ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

В стационарных условиях флюоресценции (см.). После окончания действия возбудителя свечения флюоресценция прекращается.

Иногда в результате безызлучательного рассеивания части энергии электрон из S1*-состояния может перейти на один из колебательных подуровней так наз. триплетного состояния (T1). При этом в молекуле появляются неспаренные электроны (см. квантовой теорией (см.) переходы типа S0<->T маловероятны; в легких атомах или двухатомных молекулах они не имеют места, в тяжелых атомах и многоатомных молекулах такие переходы возможны. Время жизни (τ) молекулы в таком состоянии может составлять от 10^-4 до 10² — 10⁴ сек. Из триплетного состояния молекула может, испустив квант света (T — S0 + hγ), перейти в основное состояние S0. Л., обусловленную таким переходом, называют фосфоресценцией. Это явление можно наблюдать длительное время и по окончании действия возбудителя свечения (послесвечение). Поскольку переход в триплетное состояние сопровождается потерей части энергии, спектр фосфоресценции оказывается смещенным в более длинноволновую часть спектра, чем спектр флюоресценции (рис. 2).

Помимо времени жизни молекулы в возбужденном состоянии (τ), процесс Люминесценции характеризуется интенсивностью (J), квантовым выходом (φ), положением максимума (λmax), спектром Л. и другими параметрами, измерение которых находит применение в лаб. практике. Напр., для чистых веществ интенсивность Л. (I) при возбуждении монохроматическим светом интенсивностью Jв равна:

I = k*Jв*φ(1—10:-D),

где k— константа, характеризующая чувствительность флюориметра, D — оптическая плотность образца. D = εCl, где ε — молярный коэффициент поглощения вещества, С— молярная концентрация, l — толщина образца. При малых D интенсивность Л. практически линейно зависит от концентрации, что широко используется в количественном люминесцентном анализе.

Л. многих веществ может быть результатом содержания в них небольшого количества примесей. Поэтому при проведении анализа важно установить, какому именно соединению свойственна Л. (рис. 3). Для этого измеряют спектры возбуждения Л. (см. Спектральный анализ). Спектры возбуждения Л. измеряют также для обнаружения процессов миграции (переноса) энергии между молекулами и т. д.

При взаимодействии молекул люминесцирующего вещества с молекулами растворителя и другими веществами наблюдается явление тушения Л., заключающееся в уменьшении квантового выхода Л. Такое тушение Л. может быть следствием образования нелюминесцирующего комплекса между люминесцирующим веществом и веществом-тушителем — тушение I ряда, при к-ром уменьшается только квантовый выход, а время жизни молекулы в возбужденном состоянии не меняется. Если молекула люминесцирующего вещества теряет часть энергии (за счет кинетических соударений с молекулами вещества-тушителя), имеет место тушение II ряда, при к-ром уменьшается и квантовый выход, и время жизни молекулы в возбужденном состоянии.

Люминесценция биологических объектов может быть собственной (первичной) или возникать за счет добавления в анализируемую систему специальных веществ или хим. модификации имеющихся (вторичная Л.).

Собственная Л. простых белков обусловлена наличием аминокислот триптофана и тирозина. Максимум флюоресценции триптофана варьирует от 330 до 350 нм в зависимости от локализации триптофана в белковой молекуле. В сложных белках собственной Л. обладают некоторые коферменты, напр, ф лавины, восстановленные пиридиннуклеотиды и др. В частности, восстановленные пиридиннуклеотиды при возбуждении УФ-светом флюоресцируют в синей области спектра (440 нм), окисленные — не флюоресцируют. Это позволяет исследовать молекулярные механизмы работы цепи переноса электронов в митохондриях, целых клетках и даже в тканях, изучать кинетику биохим, реакций in vivo и др. Микрофлюориметрически можно регистрировать кинетику изменения содержания восстановленных пиридиннуклеотидов и других флюоресцирующих коферментов в различных областях одной клетки in vivo, когда использование других методов затруднено. Собственная Л. наблюдается у витаминов А, B6, E и др., у многих лекарственных препаратов (хинин, гризеофульвин и др.). С ее помощью с очень высокой чувствительностью и специфичностью определяют канцерогенные углеводы — бенз(а)пирен, дибензантрацен и др.— в воздухе городов, в табачном дыме и др. Первичную Л. используют в диагностических целях — для обнаружения грибковой инфекции у человека и дерматомикозов у животных по характерной желто-зеленой флюоресценции пораженных волос, возбуждаемой УФ-облучением при длине волны 365 им. По собственной Л. проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца, зараженные бактериями рода Pseudomanas при возбуждении УФ-светом начинают интенсивно флюоресцировать (за счет пигмента пиовердина, вырабатываемого бактериями).

Многие соединения, не обладающие собственной Л., начинают люминесцировать после соответствующей хим. обработки. Таким путем в биол, материалах удается определять витамины С, D, В¹² и др., наркотики (с чувствительностью до 0,02 мкг в пробе) морфин, героин и др. Вторичную Л. используют также в диагностике болезней.

При изучении структуры и функции биол, мембран, структурной организации макромолекул белков и нуклеиновых к-т широко используют вторичную Л. соединений, называемых флюоресцентными зондами. В качестве таких зондов выбирают вещества, параметры Л. которых резко меняются в зависимости от характеристики окружающей их среды: полярности, вязкости, по

верхностного заряда и др. Зонды бывают трех типов: заряженные (напр., 1-анилинонафталин-8-сульфонат, 2-толуидинонафталин-6-сульфонат и др.), незаряженные, но обладающие значительным дипольным моментом (напр., 4-диметиламинохалкон, 3-метоксибензантрон и др.), не имеющие ни заряда, ни значительного дипольного момента (напр., перилен, метилантрацен, пирен, ретинол и др.). Как правило, в качестве флюоресцентных зондов используют молекулы, которые в воде почти не флюоресцируют, а при связывании с биол, мембранами или белками интенсивность их Л. возрастает в десятки раз. С помощью таких зондов удалось определить, в частности, вязкость углеводородной части биол, мембран (напр., показано, что вязкость мембран дисков наружных сегментов палочек сетчатки равна примерно 1 пз, что соответствует вязкости η оливкового масла). С помощью зондов изучают взаимное расположение молекулярных компонентов и конформационные перестройки биол, мембран и белков, фазовые переходы. При изучении структуры нуклеиновых к-т применяют акридиновый оранжевый и другие зонды. Показано, напр., что максимум Л. двуспиральной, нативной ДНК располагается в зеленой области спектра (530 нм), тогда как в одноцепочечной ДНК и РНК он смещается в красную область (640 нм). Микрофлюориметрически с помощью зондов анализируют ДНК непосредственно в клетках.

В медицинской технике широкое распространение получили люминофоры (см.) — вещества, способные к фото-, рентгено-, катодолюминесценции и т. д. По химической природе их можно разделить на органические и неорганические. Неорганические люминофоры используют в люминесцентных лампах. При изготовлении рентгеновских экранов применяют цинккадмийсульфидные люминофоры, способные к рентгенолюминесценции. К люминофорам органической природы могут быть отнесены флюоресцентные зонды.

Люминесцентный анализ

Люминесцентный анализ — метод исследования различных объектов (в т. ч. биологических), основанный на наблюдении их Люминесценция.

Качественный и количественный люминесцентный анализ широко применяют при гиг. исследованиях пищевых продуктов, для выявления некоторых загрязнений окружающей среды, в экспериментальной гигиене при составлении научно обоснованных нормативов, в судебной экспертизе живых лиц, трупов и вещественных доказательств. Люминесцентным анализом широко пользуются в микробиологии и вирусологии.

При мед. исследованиях измеряют как собственную, первичную, флюоресценцию объектов, так и вторичную флюоресценцию, возникающую за счет специальных красителей — флюорохромов (см.) люминесцентных зондов. Анализ первичной Л. органов и тканей проводят чаще всего визуально с помощью очков-светофильтров или специальных приборов, позволяющих исследовать свечение в различных наружных полостях и осуществлять фотосъемку. Таким способом можно определить микроспорию (по зеленому свечению волос), подкожные кровоизлияния (по тушению флюоресценции гемоглобином), аномалии пигментации (по отсутствию свечения пигментированной кожи), себорейную экзему, гиперкератоз и ряд других дерматозов (по изменению спектра и интенсивности флюоресценции кожи), нарушение кровообращения в кожных лоскутах при пластике лоскутом на ножке (по отсутствию свечения кожи или введенного в кровь флюоресцеина), раннюю стадию желтухи (при освещении слизистой оболочки полости рта УФ-светом желчные пигменты приобретают вид темно-бурых пятен с коричневым оттенком), кариес зубов (по отсутствию свечения пораженных участков зуба).

Применение флюороскопии для диагностики злокачественных опухолей пока не оправдало себя из-за противоречивости результатов. С этой целью целесообразно использовать более достоверный люминесцентно-цитологический метод (см. Люминесцентная микроскопия).

В мед. исследованиях применяют различные флюорохромы, особенно флюоресцеин. Интенсивность свечения этого соединения настолько велика, что оно обнаруживается даже в очень незначительных концентрациях. Через несколько секунд после внутривенного введения 1 — 2 мл 10 —15% р-ра флюоресцеина появляется ярко-зеленое свечение 'слизистой оболочки полости рта, губ, глаз и других участков тела. Флюоресцеин безвреден и выводится из организма за 50—70 час. Флюоресцеиновую пробу используют для определения скорости циркуляции крови, для исследования проницаемости капилляров кожи и влияния на нее лекарственных препаратов, для обнаружения затеков цереброспинальной жидкости, выявления границ опухолей с целью их удаления.

Люминесцентный анализ помогает отдифференцировать туберкулезные гранулемы от туберкулезоподобных, обнаруживаемых в лимфатических узлах при осмотре свиных туш. За 3—5 мин. можно установить концентрацию белка в исследуемых образцах молока (вместо 8 —12 час. по методу Кьельдаля), причем среднее расхождение с методом Кьельдаля составляет не более 0,1%.

Широкое применение нашли флюорохромы в люминесцентно-гистол. исследованиях. Использование люминесцентных методов в клин, и экспериментальной биохимии позволяет резко повысить чувствительность исследований, приблизив ее в некоторых случаях к уровню чувствительности радиоизотопных анализов. Разработаны флюориметрические методики определения активности ряда ферментов, количественного определения аминокислот, аминов, витаминов, коферментов и их метаболитов, белков, стероидов, мочевой к-ты, аммиака, глюкозы, окситетрациклина, салицилатов, ионов Ca2+, Mg2+, пуринов, пиримидинов, нуклеиновых к-т, порфиринов и других соединений.

Для оценки физ.-хим. процессов, протекающих в организме, а также в качестве дополнительного диагностического теста может быть применено исследование хемилюминесценции плазмы крови. Имеются данные, что сверхслабое свечение сыворотки крови снижается при злокачественных новообразованиях и атеросклерозе и повышается при туберкулезе. По интенсивности хемилюминесценции можно судить о степени окисления, уровне свободных радикалов и отклонении его от нормы, что существенно, напр., при лучевом поражении.

Люминесцентный анализ в гигиене нашел широкое применение для определения порчи или фальсификации пищевых продуктов, количественного установления содержания в них витаминов и других биологически активных веществ или вредных примесей (пестицидов и др.). Доброкачественность мяса определяют, измеряя люминесценцию его безбелкового экстракта, обусловленную присутствием водорастворимых веществ, образующихся при порче мяса. Величина Л. экстракта из свежего мяса — до 30 относительных единиц, из мяса с начальными признаками порчи — от 30 до 50 относительных единиц, из испорченного мяса — более 50 относительных единиц. Доброкачественность мяса определяют также качественно — но цвету свечения. В зависимости от степени порчи мяса последовательно появляется зеленоватое, голубоватое и ярко-красное свечение; при начальных признаках порчи на жире свинины появляются светло-голубые точки свечения, на жире говядины — беловато-желтые. С помощью люминесцентного анализа устанавливают также свежесть рыбы и рыбных продуктов.

С помощью люминесцентного анализа определяют присутствие и концентрацию в воздухе производственных помещений смолистых веществ, бензатрена, нафтиламинов, борной к-ты, нафталонов, фталатов и др., содержание в воде нефтепродуктов, сульфатов, ацетона, урана и т. п. Разработан спектрально-люминесцентный метод определения полициклических ароматических углеводородов в пробах воды, снега и почвы; бенз(а)пирена — в атмосферном воздухе, табачном дыме, некоторых пищевых продуктах.

Люминесцентный анализ в судебно-медицинских исследованиях. Высокая чувствительность люминесцентного анализа и возможность с его помощью идентифицировать по характеру свечения многие вещества, а также ряд органов и тканей делают его весьма важным методом исследования при суд.-мед. экспертизе. В суд.-мед. практике при проведении люминесцентного анализа используют любые источники УФ-света. Мешающий наблюдению Л. видимый свет устраняют соответствующими светофильтрами. Л., вызываемая светом видимой части спектра, наблюдается невооруженным глазом и может быть зафиксирована на фотопленке.

Широко применяется и микроскопический люминесцентный анализ, проводимый с помощью люминесцентных микроскопов. Для усиления слабого собственного свечения и для выявления не обладающих Л. структур гистол, препараты обрабатывают флюорохромами (акридиновым оранжевым, рибофлавином и т. д.).

При освидетельствовании живых лиц люминесцентный анализ позволяет установить форму и размеры подкожных кровоизлияний и кровоподтеков после исчезновения их внешних проявлений, форму бывших ранее ожогов, давность кожных рубцов по цвету их Л. (темно-фиолетовое свечение свежих рубцов, сине-фиолетовое свечение рубцов давнего происхождения), умышленное введение различных веществ (нефтепродуктов, инфицированных материалов) под кожу с целью вызывания флегмон и т. д.

При вскрытии трупов можно с помощью люминесцентного анализа доказать прием лекарственных препаратов и некоторых пищевых продуктов (яичного желтка, чеснока, крепкого чая, грибов и др.) по цвету свечения слизистой оболочки полости рта, пищевода и желудка; можно приблизительно установить возраст покойного по интенсивности и цвету свечения хрящевой ткани (напр., при исследовании расчлененных трупов). Люминесцентный анализ помогает установить срок захоронения, а также дифференцировать по характеру свечения кости погребенных и сожженных трупов, четко определить границы некоторых патол, процессов (склеротических, жировой дистрофии, злокачественных новообразований и др.), подтвердить предполагаемое отравление свинцом, хинином и другими веществами (при свинцовых отравлениях в вытяжках из мочи очень рано определяется красноватое свечение порфиринов, при отравлении акрихином, хинином и другими веществами, обладающими яркой Л., отмечается соответствующее свечение внутренних органов).

Исследуя одежду и другие вещественные доказательства с помощью люминесцентного анализа, можно установить входное отверстие при огнестрельном ранении, а при множественных повреждениях — их последовательность. При различных транспортных происшествиях люминесцентный анализ помогает определить на одежде и теле пострадавшего форму и расположение загрязнений смазочными маслами и по ним установить характер повреждающего предмета и взаимное положение транспорта и пострадавшего в момент происшествия. Можно ориентировочно установить наличие на вещественных доказательствах крови (по яркому оранжевому свечению гематопорфирина после денатурации гемоглобина серной к-той), выделений из носа, слюны, спермы, мочи, определить половую принадлежность клеточных элементов на орудиях преступления и других предметах (путем выявления Y-хромо-сомы при люминесцентной микроскопии объектов). Присутствие крови на вещественных доказательствах можно также доказать путем спектрального исследования Л. гематопорфирина. В суд.-мед. практику интенсивно внедряются методы иммунофлюоресценции (см.).

См. также Фотохимические реакции.

Методы анализа и приборы

Методы анализа и приборы, основанные на явлении Л., применяют для получения информации о структуре и физ.-хим. свойствах биологических и других объектов, измерения концентрации веществ, а также для исследования изменения состояния или концентрации веществ в таких объектах. С этой целью чаще используют фосфоресценцию (см.).

При решении ряда практических задач в биологии и медицине (напр., определение концентрации тех или иных веществ в биол, жидкостях, изучение их иммунол, характеристик, гистол, показателей и т. д.) можно ограничиться измерением интенсивности флюоресценции в определенной спектральной области при определенной длине волны возбуждающего света.

Приборы для флюоресцентного анализа делят на две основные группы — флюориметры (см. Спектральный анализ).

Основные элементы флюоресцентных приборов — источник света, камера (кювета) для анализируемого объекта, приемник света и регистрирующее устройство. Во флюориметрах обычно используют источники света с линейчатым спектром (чаще ртутно-кварцевые лампы), а в спектрофлюориметрах — с непрерывным спектром (ксеноновые лампы). Коротковолновая граница возбуждения флюоресценции ксеноновой лампы находится в области 240 нм, длинноволновая граница в области 600—800 нм. Для выделения определенных участков спектра излучения лампы (монохроматизации) во флюориметрах используют светофильтры из цветного оптического стекла или интерференционные светофильтры. Для монохроматизации возбуждающего света в спектрофлюориметрах чаще используют монохроматоры с дифракционными решетками с разрешающей способностью 10—12 нм. Диапазон работы монохроматора флюоресценции определяется спектральной чувствительностью фото приемник а и назначением прибора. Рабочий диапазон монохроматоров, применяемых в большинстве моделей спектрофлюориметров, от 280 до 700 нм.

Камеры для анализируемого объекта представляют собой кюветы из стекла специальных сортов, в зависимости от назначения имеющие различную емкость, конструкцию и т. д. Объем кювет в приборах 1 —10 мл. В ряде приборов используют микрокюветы объемом 2 мкл. Дальнейшее усовершенствование кювет связано с повсеместным введением микрокювет, сливных и проточных кювет.

Наиболее употребительным приемником света, обладающим высокой чувствительностью, являются фотоэлектронные умножители (см. Фотоумножители), фотоэлементы, а также болометры, позволяющие измерять энергию излучения непосредственно.

Регистрирующие устройства представляют собой аналоговые и цифровые схемы регистрации: микро-амперметры, перьевые записывающие устройства, печатающие записывающие устройства и др.

Конструктивной разновидностью являются микрофлюориметры и микроспектрофлюориметры, предназначенные для проведения люминесцентного анализа микроскопических объектов. При измерении спектров большое значение имеет автоматическая коррекция спектра флюоресценции, т. к. регистрируемая прибором интенсивность определяется не только физическими свойствами образца, но и спектральными характеристиками источника света, монохроматоров и приемника света. Автоматическая коррекция достигается, как правило, усложнением оптической или электронной схемы приборов.

Изучение Люминесценции хромофоров в составе биологических молекул и структур составляет один из разделов исследований в молекулярной биологии. Оно позволяет получать информацию об общем строении молекул и надмолекулярных структур, о локализации в них хромофоров, подвижности отдельных участков молекул, структурных (конформационных) превращениях молекул и т. д. Напр., спектры и квантовый выход Л. аминокислот различны в составе белка и просто в растворе; кроме того, изменение белка, отражаясь на микроокружении аминокислот — флюорофоров, приводит к изменению белковой Л., вследствие чего триптофан и тирозин являются как бы люминесцентными метками, встроенными в белок самой природой и информирующими об условиях, в к-рых они находятся в макромолекуле. Флюоресцентные методы используются при анализе конформационных перестроек белковых молекул в составе ферментативных систем, изучении механизмов фотосинтетических реакций, структурной организации мембран и пр. Для определения содержания нефлюоресцирующих продуктов применяют флюорохромы (см.) и флюоресцентные зонды — флюоресцентные методы выявления ДНК и РНК в цитохимии, определение концентрации микроорганизмов, содержания плазминогена и фибриногена в плазме крови и пр., основанные на связывании флюорохрома с молекулами и клеточными структурами.

Недостатком флюоресцентных методов количественного анализа является ограниченная селективность, связанная с тем, что многие вещества имеют большую ширину спектра флюоресценции. Наметились следующие пути повышения их селективности: оптические или электронные модификации существующих флюоресцентных методов, комбинация флюоресцентной спектроскопии и хроматографических методов, комбинация флюоресцентных методов и специфических биохим, тестов.

При производной флюоресцентной спектроскопии измеряют так наз. производные спектры, т. к. при анализе смесей таким способом разрешение минорных компонентов существенно повышается. Производные спектры можно получать как оптическим путем, так и с помощью специальных электронных приставок. Этот способ пригоден, напр., для идентификации тирозина в белке, содержащем тирозин и триптофан. Метод синхронного сканирования основан на одновременном сканировании обоих монохроматоров спектрофлюориметра с фиксированным спектральным сдвигом между ними.

Флюориметрическое сканирование тонкослойных хроматограмм позволяет разделять пикограммы веществ.

Для сканирования тонкослойных хроматограмм в нек-рых случаях выгоднее использовать фосфориметрический анализ, т. к. многие нефлюоресцирующие вещества фосфоресцируют (см. Фосфоресценция).

Перспективным способом повышения селективности флюоресцентного количественного анализа является комбинация флюориметрии и иммунологических методик, напр, дифференциальное окрашивание хромосом с помощью флюоресцентного красителя хинакрин-иприта для последующего флюоресцентного анализа кариотипа и метод флюоресцирующих антител, используемый при постановке высокочувствительных иммунологических реакций и выявлении различных антигенных детерминант на поверхности клеток (см. Иммунофлюоресценция), и т. д.

Библиография:

Биофизика, под ред. Б. Н. Тарусова и О. Р. Колье, М., 1968;

Владимиров Ю. А. и Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, М., 1972; Гладков А. А. Люминесцентный анализ в медицине, Кишинев, 1958, библиогр.; Журавлев А. И. и Журавлева А. И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике, М., 1975, библиогр.; Карнаухов В. Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки, М., 1978, библиогр.; Конев С. В. и Волотовский И. Д. Введение в молекулярную фотобиологию, Минск, 1971, библиогр.; Кощеев А. К., Лившиц О. Д. и Добросердова И. И. Люминесцентный анализ пищевых продуктов, Пермь, 1974, библиогр.; Лабораторные и специальные методы исследования в судебной медицине, под ред. В. И. Пашковой и В. В. Томилина, с. 98, М., 1975; Макаренко И. А. Люминесцентная цитодиагностика и ее значение в профилактике рака матки, Минск, 1973, библиогр.; Новиков Ю.В. и Гуров Ф. И. Люминесцентный анализ в гигиенических исследованиях, Гиг. и сан., № 12, с. 74, 1970, библиогр.; Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине, пер. с англ., М., 1965.; Каралис В.Н. Флуоресцентные приборы, М. , 1978; Кац А. М. и Канторович А. С. Руководство по приборам и оборудованию для медикобиологических исследований, Л., 1976; Паркер С. Фотолюминесценция растворов, пер. с англ., М., 1972; Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине, пер. с англ., М., 1965; Miller J. N. Fluorimetry and phosphorimetry in clinical analysis, Proc. Analyt. Div. Chem. Soc., v. 16, p. 56, 1979, bibliogr.; Stein S., Rubinstein M. a. Udenfriend S. Ultramicroanalysis of peptides, Psychopharm. Bull., v. 14, № 4, p. 29, 1978; Thomas D. D. Largescale rotational motions of proteins detected by electron paramagnetic resonance and fluorescence, Biophys. J., v. 24, p. 439, 1978, bibliogr.

A. Я. Потапенко; Ю. В. Новиков (гиг.), B. А. Пеккель (люминесцентный анализ), В. В. Томилин (суд.); P. P. Лидеман, H. П. Матвеева.