ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Описание
Люминесцентная микроскопия (лат. lumen, luminis - свет; греч. mikros малый + skopeo рассматривать, исследовать; син. флюоресцентная микроскопия) — метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав. Люминесценция (см.) возбуждается коротковолновой (сине-фиолетовой) частью видимого света либо ультрафиолетовыми лучами с длиной волны, близкой к видимому свету. Цвет люминесценции, т. е. длина волны излучаемого света, зависит от химической структуры и от физикохимического состояния микроскопируемого объекта, что и обусловливает возможность использования Люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клетки. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины A, B2, B1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведенная, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями — флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках (напр., флюоресцеин), другие —избирательно связываются с определенными структурами клетки или даже с определенными хим. веществами. Эта способность флюорохромов к избирательному окрашиванию позволяет проводить люминесцентно-цитологические и люминесцентно-цитохимические исследования.
В истории развития Л. м. выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:
1) доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа; 2) создание в 1911 г. люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М. С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток; 3) применение сильно разбавленных р-ров флюорохромов, избирательно связывающихся с определенными структурами клеток [Хайтингер (М. Haitinger, 1933— 1935)], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер (S. Strugger), 1940]; 4) разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки (E. М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953) и выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе (МЛ-1, МЛ-2, ОИ-17); 5) создание метода иммунофлюоресценции (см.), нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико-биол. исследований [Кунс (А. Н. Goons), 1942, 1950].
В СССР значительный вклад в развитие и распространение Люминесцентной микроскопии в медико-биологических исследованиях сделан М. Н. Мейселем.
Для проведения Л. м. применяют либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биол, микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов (см. Микроскоп). Устройство люминесцентных микроскопов основано на некоторых физ. законах люминесценции. Один из них — закон Стокса, согласно к-рому максимум спектра люминесценции смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждающего света. Это позволяет использовать для Л. м. принцип скрещенных светофильтров, который заключается в том, что коротковолновое световое излучение (ультрафиолетовое, сине-фиолетовое), возбуждающее люминесценцию, выделяется возбуждающим светофильтром, помещенным перед осветителем микроскопа. После прохождения препарата, в к-ром возбуждается люминесценция, этот свет полностью поглощается запирающим светофильтром, пропускающим более длинноволновый свет люминесценции.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения к-рого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой (или набором таких пластинок), применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак-иллюминатор, используемая в отечественных люминесцентных микроскопах (а в последнее время и в люминесцентных микроскопах, выпускаемых зарубежными фирмами), имеет ряд существенных преимуществ: 1) интерференционная светоделительная пластинка с нанесенными на нее слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции; 2) объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещенность препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвертой степени апертуры объектива; 3) люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа. Источниками освещения для Л. м. чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также ксеноновые лампы и кварцево-галогенные лампы накаливания. В качестве светофильтра применяют окрашенное в массе оптическое стекло или используют интерференционные светофильтры, имеющие лучшие спектральные характеристики.
Для возбуждения люминесценции при Л. м. пользуются также оптическими квантовыми генераторами— лазерами, излучение которых обладает высокой интенсивностью и монохроматичностью. При этом отпадает необходимость в применении возбуждающих светофильтров.
Поскольку для возбуждения люминесценции при Л. м. обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зеленую область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычную стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стекла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям.
В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный р-р глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт и др.).
Наряду с визуальной оценкой люминесцентно - микроскопического изображения применяют его микрофотографирование (см. Микрофотография). Люминесцентная микрофотосъемка имеет ряд особенностей. С одной стороны, недостаточная яркость свечения требует длительной экспозиции, с другой — под влиянием возбуждающего света интенсивность люминесценции быстро снижается, препараты выцветают, живые клетки повреждаются, погибают, и поэтому невозможно регистрировать динамику процессов, происходящих в клетках. Для преодоления этих затруднений необходимо использовать фотоматериалы с высокой общей и избирательной спектральной чувствительностью, высокоапертурные объективы, оку-ляры с минимальным собственным увеличением, однако достаточным для передачи деталей объекта, малоформатные микрофотонасадки. Возможна также обработка препаратов веществами, уменьшающими выцветание (гидрохиноном и т. д.).
М. Я. Корном и М. М. Бутсловым с сотр. (1968) разработана аппаратура и методика цветной люминесцентной микрофото- и киносъемки с использованием электронно-оптических усилителей яркости, позволяющих на несколько порядков уменьшить экспозицию и проводить регистрацию динамики процессов, происходящих в живых клетках.
Для количественной регистрации интенсивности люминесценции структур микрообъектов — цитофлюориметрии — применяют преимущественно фотоэлектрические методы с использованием фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в качестве чувствительного регистрирующего прибора (см. Фотоумножители). Используют также метод регистрации интенсивности люминесценции клеток и их структур в определенных участках спектра — цитоспектрофлюориметрию. Преимущества цитофлюориметрии перед абсорбционной цитофотометрией — ее более высокая чувствительность, отсутствие влияния характера распределения вещества в клетке пли структуре клетки на результаты измерений.
Одним из вариантов количественной регистрации люминесценции микрообъектов является метод импульсной цитофлюориметрии (цитофлюориметрии в потоке) и «сортировки» клеток по люминесцентным характеристикам. Эти методы позволяют проанализировать интенсивность люминесценции десятков тысяч клеток в минуту и провести их разделение по характеру люминесценции. Среди методов люминесцентного изучения микрообъектов наибольшее распространение получили прямое флюорохромирование — окрашивание флюорохромами и иммунофлюоресценция.
Отечественная промышленность выпускает различную аппаратуру для Л. м. Наиболее широко используется микроскоп МЛ-2, выпускаемый в нескольких вариантах. Производится также серия унифицированных люминесцентных микроскопов «Люмам», а также люминесцентные осветители с кварцевыми галогенными лампами (ОИ-28, ОИ-30).
Микроскопы серии «Люмам» состоят из унифицированных узлов, различные комбинации которых позволяют получить три рабочие модели (Р1 — РЗ) и три исследовательские (И1 — И3), отличающиеся друг от друга комплектацией и возможностями использования (рис. ).
Осветители ОИ-28 и ОИ-30 устанавливают на обычные биологические микроскопы; они предназначены для освещения объектов сверху через опак-иллюминатор светом, возбуждающим видимую люминесценцию.
Осветитель ОИ-30 отличается тем, что в его комплект входят контактные объективы.
Люминесцентную микроскопию широко применяют в вирусологии, микробиологии, гематологии, клин, цитодиагностике (особенно в онкологии для обнаружения малигнизированных клеток), в цитогенетике для изучения хромосом. С этой целью на протяжении длительного времени используют флюорохром акридиновый оранжевый; применяют также флюорохромы бромистый этидий (этидиум бромид) и йодистый пропидий (припидиум йодид), преимущественно для цитофлюориметрии ДНК, а также люминесцентные варианты реакции Фейльгена. Акридиновый оранжевый получил распространение в люминесцентной микроскопии нуклеопротеидов благодаря тому, что комплексы, образованные этим флюорохромом с двуспиральной ДНК, обладают зеленой люминесценцией, а комплексы с РНК и односпиральной ДНК — красной люминесценцией. Известны также люминесцентно-цитохим. методы выявления белков и липидов. Для качественного и количественного изучения локализации белков в клетках используют проционовые красители, флюорескамин, а липидов — 3,4-бензпирен, фосфин ЗР и др. Тетрациклин и его производные применяют для люминесцентно-микроскопического изучения костной ткани и некоторых изменений в клетках при малигнизации.
Л. м. в сочетании с прямым флюорохромированием фиксированных препаратов используют при бактериоскопической диагностике для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий, гонококков, возбудителей дифтерии, возбудителей малярии в мазках крови и др. Преимущества этого метода заключаются в его более высокой чувствительности по сравнению с обычными методами окраски (напр., окраски по Цилю—Нельсену). Флюорохромирование применяют также в санитарно-бактериол. исследованиях для обнаружения и подсчета микроорганизмов в воде и почве. Одним из методов люминесцентномикроскопической диагностики является обнаружение микроколоний на мембранных фильтрах после кратковременного подращивания и флюорохромирования.
Еще в 1940 г. Штруггер предложил использовать акридиновый оранжевый для дифференциации живых и мертвых бактерий, однако последующие исследования показали недостаточную надежность этого метода. В связи с этим для определения жизнеспособности клеток (в частности, при воздействии на них цитотоксических факторов) используют диацетат флюоресцеина или его сочетание с бромистым этидием. Нелюминесцирующий эфир флюоресцеина расщепляется эстеразами жизнеспособной клетки с освобождением ярко люминесцирующего зеленым флюоресцеина, а бромистый этидий обусловливает красную люминесценцию только мертвых клеток.
Для изучения физ.-хим. состояния мембран клеток используют так наз. гидрофобные флюоресцентные пробы. С этой целью клетки обрабатывают веществами, которые не люминесцируют в р-ре, но начинают люминесцировать, связываясь с гидрофобными участками мембран клетки, причем интенсивность и цвет люминесценции зависят от хим. строения и физ.-хим. состояния структур, с к-рыми связаны эти флюорохромы. Одним из наиболее распространенных веществ такого рода является 1-анилино-S-нафталин-сульфоновая к-та (1,8 АНС).
Методом изучения физ.-хим. состояния макромолекул, с к-рыми связаны флюорохромы в различных клеточных структурах, является также поляризационная люминесцентная микроскопия.
Существенное преимущество Люминесцентной микроскопии перед другими методами микроскопического исследования — возможность прижизненного (цветн. рис. 1—3) и суправитального флюорохромирования с использованием очень низких малотоксичных концентраций флюорохромов. При этом различные флюорохромы могут связываться с разными структурами клеток. Акридиновый оранжевый, напр., накапливается в лизосомах живой клетки, и они начинают люминесцировать красным светом. Такую же люминесценцию приобретают фагоцитированные бактерии внутри фагосом. Тетрациклин связывается с митохондриями клеток или их аналогами у бактерий и люминесцирует желто-зеленым светом, причем интенсивность люминесценции (количество связавшегося тетрациклина) зависит от чувствительности бактерий к этому антибиотику.
Возможно также флюорохромирование клеток и тканей in situ для изучения их с помощью контактной Л. м.
Люминесцентная микроскопия вирусов применяется при лаб. диагностике вирусных заболеваний для выявления вирусного антигена в клетках, изучения хим. состава внутриклеточных вирусных включений, определения относительной концентрации вирусных антигенов и нуклеиновых к-т по интенсивности специфической флюоресценции и т. д. В зависимости от целей исследования в качестве объектов используют мазки, отпечатки, соскобы тканей или препараты клеточных культур.
В современной вирусологии наиболее распространены два метода Л. м.: 1) идентификация и дифференциация нуклеиновых к-т вирусов в инфицированных клетках и очищенных вирусных суспензиях с помощью флюорохромов аминоакридинов; 2) выявление вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции.
Из аминоакридинов чаще применяют акридиновый оранжевый, придающий молекулам двуспиральных нуклеиновых к-т (как правило, ДНК) зеленую, а односпиральных нуклеиновых к-т (как правило, РНК) рубиново-красную флюоресценцию (цветн. рис. 4—8). Метод применим как на нативных препаратах, так и после фиксации в ацетоне, жидкости Карнуа и др. Результаты окраски в значительной мере зависят от концентрации (обычно 1 : 10 000 — 1 : 100 000) и pH флюорохрома.
Метод иммунофлюоресценции используют для идентификации вирусов в клетках, изучения динамики накопления вирусного антигена в клетке, определения внутриклеточной локализации скоплений вируса, выяснения природы вирусных включений, изучения антигенной структуры вирусов, дифференциации близкородственных вирусов, титрования вирусов в клеточных культурах, выявления антигенов опухолеродных вирусов в тканях и клетках, изучения патогенеза вирусных заболеваний, контроля вирусной контаминации клеточных культур, исследования хрон, вирусных инфекций и т. д. Метод применим как в прямой, так и в непрямой модификациях. Для правильной интерпретации результатов исследования важно учитывать концентрацию и чистоту применяемых антител и их конъюгатов с флюорохромами, сроки и температуру фиксации препаратов (обычно ацетоном) и обработки их антителами. Наиболее часто для метки антител используют изотиоцианат флюоресцеина (ФИТЦ), дающий характерное зеленое свечение (цветн. рис. 9), и сульфохлорид лиссамин-родамина В 200, светящийся оранжево-красным светом.
Метод иммунофлюоресценции допускает также выявление в клетках и тканях антител к вирусным антигенам.
Л. м. вирусов применяют для диагностики таких инфекций, как оспа, герпес, эпидемический паротит и др. Особое значение имеет Л. м. в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, когда отпечатки со слизистой оболочки носа больных (риноцитограммы) обрабатывают с помощью названных выше методов с целью выявления антигенов или определения типа нуклеиновых к-т. Т. о. проводят дифференциальную диагностику между инфекциями, вызванными вирусами гриппа А2 или В, парагриппа, аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом или сочетаниями названных вирусов. Возможна также диагностика путем Л. м. клеточных культур, инфицированных материалом больных. Окончательный диагноз во всех случаях ставят по сочетанию данных Л. м. с результатами вирусологических и серологических исследований больных.
Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патол, гистологии. Основными преимуществами Л. м. являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим, методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение, возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин B2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин B1 в щелочном р-ре переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной к-ты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохим, количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.
Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами (см.). Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитол, и гистол, препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда (участки ишемии имеют зелено-желтую люминесценцию). Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы, как кофеин 5 и родамин, могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин 3Р применяют для определения липидов, с этой же целью используют р-р 3,4-бензпирена в насыщенном р-ре кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин Т. S. окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью р-ра морина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов р-ром солохрома черного удается выявить алюминий (желто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в легких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).
С помощью метода иммунофлюоресценции можно выявить гормоны, антигены и антитела (цветн. рис. 9), различные продукты обмена, идентифицировать гистогенетически незрелые опухоли, различные инфекционные заболевания и т.д. Развитие иммунохимии еще больше расширило возможности этого метода. Появилась возможность определять с помощью искусственных гаптенов небелковые вещества в тканях и клетках.
См. также Микроскопические методы исследования.
Библиография: Барский И. Я., Поляков Н. И. и Якубенас В. А. В. Контактная микроскопия, М., 1976, библиогр.; Ершов Ф. И. Люминесцентное микроскопическое выявление ранних изменений нуклеиновых кислот и липидов в инфицированных клетках, Вопр, вирусол., .No 1, с. 3, 1964, библиогр.; 3еленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой, М., 1971, библиогр.; 3убжицкий Ю. Н. Метод люминесцентной микроскопии, Л., 1964, библиогр.; Кармышева В.Я. Применение метода флюоресцирующих антител в вирусологии, М., 1979; Мейсель М. Н. Флуоресцентная микроскопия и цитохимия в общей микробиологии, в кн.: Усп. микробиол., под ред. А. А. Имшенецкого, т. 7, с. 3, М., 1971; Михайлов И. Ф. и Дьяков С. И. Люминесцентная микроскопия, М., 1961, библиогр.; Струков А. И. и Кондратьев В. С. Люминесцентно-микроскопический метод в патологоанатомической практике, Арх. патол., т. 28, № 8, с. 77, 1966, библиогр.; Фридман И. А. и Кустаров Н. П. Люминесцентные цитологические исследования в акушерско-гинекологической практике, Л., 1974, библиогр.; Automation in microbiology and immunology, ed. by C.-G. Heden a. T. Illeni, N. Y., 1975; The automation of uterine cancer cytologv, ed. by G. L. Wied a.o., Chicago, 1976; Сaspersson T. a.o. DNA-binding fluoro-chromes for the study of the organization of the metaphase nucleus, Exp. Cell Res., v. 58, p. 141, 1969; Fluorescence techniques in cell biology, ed. by A. A. Thaer a. M. Sernetz, N.Y., 1973; Vaillier J. a. Vaillier D. Characterization of cell subpopulations of the thymus by a hydrophobic fluorescent probe, l-anilino-8-naphthalene sulphonate, Clin. exp. Immunol v. 30, p. 283, 1977.
М. Я. Корн; В. А. Варшавский (пат. ан.), Я. E. Хесин (вир.).