ЛИПАЗЫ

ЛИПАЗЫ (КФ 3.1.1.3) — ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление триглицеридов (нейтральных жиров) на составляющие их жирные кислоты и глицерин, которые используются организмом в качестве энергетического и пластического материала. Кроме того, Л. выполняют ряд специфических функций. Так, гормоночувствительная липаза участвует в мобилизации жирных к-т из жировых депо, а панкреатическая липаза играет большую роль в процессе всасывания жира в пищеварительном тракте (см. поджелудочной железы (см.). Генетически обусловленная недостаточность некоторых Л. является причиной ряда наследственных заболеваний.

Препараты Л. находят применение в медицине в качестве лекарственных средств, используемых для заместительной терапии при заболеваниях поджелудочной железы, а также при заболеваниях печени и желчного пузыря. Л., получаемые из микроорганизмов, применяются в животноводстве в качестве кормовых добавок, усиливающих липолиз в кишечнике у молодых животных, в парфюмерии — как составная часть косметических кремов, в пищевой промышленности — для придания сырам специфического вкуса и аромата. Кроме того, препараты Л. используются для обезжиривания кож, растительных волокон, шелка-сырца, в производстве моющих средств, содержащих ферментные добавки.

Л. изучены не так глубоко и подробно, как некоторые ферменты белкового и углеводного обмена. Тем не менее высокоочищенные Л. получены из поджелудочной железы человека, свиней, крупного рогатого скота, крысы, из молока, из микроорганизмов Geotrichum candidum, Rhizopus arrhizus, из семян хлопчатника, из рисовых отрубей. Было установлено, что панкреатическая липаза и липаза из Rhizopus arrhizus представляют собой гликопротеиды (см.). В составе панкреатической липазы обнаружен специфический кофактор белковой природы, названный колипазой. Изучен аминокислотный состав некоторых Л. Для большинства Л. доказано, что они являются серин-гистидиновыми ферментами.

Характерной особенностью Л. является их способность функционировать на поверхности масляной капли, образуемой совершенно безводным субстратом. Т. о., ферментсубстратное взаимодействие протекает на поверхности раздела между агрегированным субстратом и водой. Анализ кинетики ферментативных реакций, катализируемых Л., находится в самой начальной стадии.

Большинство Л. способно гидролизовать в триглицеридах только первичные эфирные связи. Как правило, стереоспецифичность у Л. отсутствует, и они одинаково хорошо гидролизуют обе первичные сложноэфирные связи. Л. плохо гидролизуют сложноэфирные связи, образованные жирными к-тами и другими спиртами. Напр., максимальная скорость гидролиза фенил-карбоновых эфиров панкреатической липазой составляют только 2% от той скорости, с к-рой она гидролизует триолеин. Считает, что Л. мало специфичны по отношению к жирным к-там различной степени ненасыщенности и длины углеродной цепи. Однако имеются и исключения, напр, липаза Geotrichum candidum обладает уникальной субстратной специфичностью по отношению к tyuc-9-ненасыщенным жирным к-там, особенно к остатку олеиновой к-ты независимо от его положения в молекуле.

Оптимальное значение pH для большинства Л. равно 8,0—9,0. Однако имеются кислые и нейтральные Л. Напр., Л. из лейкоцитов человека наиболее активна при pH 5,25. Гормоночувствительная Л. проявляет максимальную, активность при pH 6,8. Необходимо заметить, что на оптимум pH липаз сильное влияние оказывает состояние субстрата на межфазной поверхности липид — вода. Л. могут действовать в широком диапазоне температур. Особенно это относится к бактериальным Л. Напр., оптимум температуры для действия Л. из Mucor pusillus равен 50°, а для Л. из Puccinia graminis tritici — 15°.

Генетически обусловленная (врожденная) недостаточность панкреатической Л. приводит к утрате способности переваривать жиры. В этом случае содержание Л. в кишечном соке составляет ок. 10% от нормального. От 50 до 80% всех поступающих с пищей жиров выделяется с испражнениями: при этом заболевании бывает обильный маслянистый кал.

Генетическая недостаточность кислой лизосомной Л. является причиной тяжелого наследственного заболевания — болезни Вольмана. Заболевание характеризуется ксантоматозом (см.), обызвествлением надпочечников и гепатоспленомегалией. При этой болезни во внутренних органах обнаруживают своеобразные пенистые клетки, содержащие большое количество триглицеридов и этерифицированного холестерина.

Биохимические методы исследования активности липаз

Биохимические методы исследования активности липаз, применяемые в клинике, основаны либо на нефелометрической регистрации убыли субстрата в ходе реакции, либо на количественном определении образующихся продуктов гидролиза: спирта или неэтерифицированных жирных к-т.

Нефелометрические методы, основанные на измерении просветления жировой эмульсии под действием фермента, удобны и просты; однако точность их невысока и в процессе гидролиза не сохраняется пропорциональность между концентрацией фермента и скоростью гидролиза. Поэтому эти методы пригодны только для быстрого получения качественных и сравнительных данных; к ним относится метод Боргстрема, предложенный для быстрого определения активности панкреатической Л. в дуоденальном содержимом. Он основан на фотометрическом измерении снижения оптической плотности (мутности) эмульсии триолеина под действием содержимого тонкого кишечника. Во время пищеварения в содержимом тонкого кишечника этим методом обнаружено 50 — 100 ед. липазной активности (за единицу активности условно принято то количество фермента, к-рое уменьшает оптическую плотность эмульсии триолеина с 0,90 до 0,80 за 1 мин.).

Большинство методов определения активности Л. основано на титриметрическом определении количества жирных к-т, образовавшихся в результате гидролиза субстрата (напр., метод Титца, по к-рому жирные к-ты титруют щелочью). Одним из лучших методов определения количества жирных к-т является описанный Доулом (V. P. Dole) метод микротитрования, включающий экстрагирование жирных к-т из реакционной смеси органическими растворителями при кислом значении pH. Хорошие результаты дают также методы Титца и Роу. Они менее трудоемки, чем метод Доула, за счет исключения стадии экстрагирования жирных к-т из реакционной смеси. Свободные жирные к-ты титруют 0,05 н. NaOH в присутствии индикатора. У здорового человека липазная активность сыворотки крови, определяемая по методу Титца, составляет 4.5 ±2,7 ед. (мкмоль/час/мл). При остром панкреатите наблюдается повышение липазной активности до 20—55 ед. (мкмоль/час/мл).

Все упомянутые методы основаны на использовании в качестве субстрата для действия Л. эмульсии оливкового масла. Описаны методы определения активности липазы с применением трибутирина в качестве субстрата. Однако необходимо помнить, что трибутирин не отвечает требованиям, которые предъявляются к субстрату Л. По-видимому, ферментативная активность, к-рую обнаруживают в биол, жидкости или экстракте по отношению к трибутирину, принадлежит совместно липазе и эстеразе. Еще менее специфичен метод определения липолитической активности сыворотки крови с использованием в качестве субстрата твина-80 (метод Шатерникова — Савчука). Твин-30, представляющий собой сложный эфир жирных к-т — пальмитиновой и олеиновой, в которых место алифатического спирта занимают производные углеводоспиртов — сорбита или маннита, не является адекватным субстратом для Л. и в значительной степени гидролизуется присутствующими в сыворотке крови эстеразами.

Чувствительность метода определения продукта липолитической реакции — жирных к-т — можно повысить, применяя колориметрические методы (см. Колориметрия). Колориметрические методы основаны на том, что освобождающиеся в результате липолиза жирные к-ты экстрагируются, омыляются и собираются в фазе органического экстрагента. Затем добавляют краситель и окрашенный комплекс регистрируют спектрофотометрически. Хорошие результаты дают колориметрические методы — метод Дамкумба, метод Дирстина с соавт., метод Медковой с соавт., основанные на образовании медных солей жирных к-т, экстрагировании их органическим растворителем и последующем определении меди в виде окрашенного комплекса с диэтилдитиокарбаматом натрия. Существуют более чувствительные модификации этих методов. Установлено, что чувствительность метода можно повысить в 4—0 раз, применяя вместо диэтилдитиокарбамата натрия 1,5-дифенилкарбогидразид.

Нормальные значения активности Л. в крови человека, определяемые колориметрическими методам и, колеблются от 0 до 199 мкмоль/мин•л. При заболеваниях поджелудочной железы активность липазы в крови может резко повышаться, особенно при остром панкреатите — до 16 000 — 68 000 мкмоль/мин•л.

Чтобы сделать определение Л. менее трудоемким и повысить его чувствительность, были предложены методы с использованием в качестве субстратов хромогенных соединений, таких как эфиры жирных к-т с эозином, флюоресцеином, нафтолом (метод Зелигмана — Крамера) и др. Под действием Л. из таких соединений освобождается спирт (эозин, флюоресцеин, нафтол и др.), который определяют или непосредственно в реакционной смеси или после проведения реакции диазосочетания. Однако эти методы, какими бы удобными они ни были, не дают надежных результатов, т. к. хромогенные субстраты плохо расщепляются истинными Л. и наблюдаемая ферментативная активность принадлежит в значительной мере неспецифическим эстeразам.

Гистохимические методы определения липаз в тканях

Л. локализуются преимущественно на мембранах эндоплазматического ретикулума и в лизосомах. В связи с большой способностью к диффузии и нестабильностью этих ферментов перед проведением гистохим, реакций необходима соответствующая фиксация материала. Для этой цели наиболее часто используют замораживание ткани или ее фиксацию в холодном нейтральном р-ре формалина с последующим приготовлением замороженных срезов.

Гистохим, определение Л. в тканях основано на реакции гидролиза специально подобранного субстрата, подвергающегося расщеплению под действием этого фермента. Образующийся продукт гидролиза связывается ионами металлов с образованием нерастворимых окрашенных солей. В качестве основной методики для выявления Л. в тканях используют реакцию Гомори, к-рая заключается в отщеплении тканевой Л. жирной к-ты от твина-80. Преимуществом твинов перед естественными субстратами Л.— жирами — является их водорастворимость. Срезы инкубируют в р-ре с pH 7,2 —7,4, содержащем твин-80. Под действием фермента из соединения с сорбитом (или маннитом) освобождается жирная к-та, к-рая осаждается присутствующими в среде ионами кальция с образованием кальциевых мыл. В дальнейшем неокрашенные кальциевые мыла в результате реакции с сернистым натрием и азотнокислым свинцом переводятся в нерастворимый сернистый свинец, осадок к-рого окрашен в коричневый цвет.

Недостаток описанных гистохим, реакций заключается в их малой специфичности: большинство этих реакций являются не избирательными для истинных Л. реакциями, а групповыми. Применение специфических ингибиторов эстераз, а также использование различных субстратов дает возможность повысить информативность гистохим. реакций на Л.

См. также Ферменты.

Библиография: Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покооп-ского, с. 186, М., 1969; Б о г e p М. М., Корни л о в а В. А. и Д и к у л ь H. М. К методике определения активности липавы крови и дуоденального содержимого, Лаборат, дело, № 8, с. 480, 1973; Б р о-к e р х о ф X. и Дженсен Р. Л аполитические ферменты, пер. с англ.. М., 1978; Л e йтес Ф. Л. Гистохим ин липо-литических ферментов в норме и при патологии липоидного обмена, М., 1907, библиогр.; М а к к ь ю с и к В. А. Наследственные признак-и человека, пер. с англ., М., 1976; M e д к о в а И. Л. и д р. Метод определения активности панкреатической липазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом и ткани поджелудочной железы, Лаборат, дело, № 3, с. 142, 1978; Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии, под ред. А. П. Авцына и др., с. 191, Л., 1971; Рахимов М. М. и Джан- б а e в a H. Р. Липолитические ферменты, Усп. совр, биол., т. 81, в. 3 (6), с. 323, 1977, библиогр.; Харрис Г. Основы биохимической генетики человека, пер. с англ., М., 1973; ШатерниковВ.А. и С а в ч у к Л. А. Определение липолитической активности сыворотки крови, Лаборат, дело, № 2, с. 84, 1966; В о г g-strom В. Determination of pancreatic lipase in human small intestina content, Scand. J. Clin. Lab. Invest., v. 9, p. 226, 1957; D esnuelle P. The lipases, в кн.: The enzymes, ed. by P. D. Boyer, v. 7, p. 575, N.Y., 1972; Dirstine P. H., S o b e 1 С. a. Henry R. J. A new rapid method for the determination of serum lipase, clin. Chem., v. 14, p. 1097, 1968; Dole V. P. a. M e i n e r t z H. Microdetermination of long-chain fatty acids in plasma and tissues, J. biol. Chem., v. 235, p. 2595, 1960; Erlanson C. a. B o r g-strom B. Tributyrine as a substrate for determination of lipase activity of pancreatic juice and small intestinal content. Scand. J. Gastroenterol., v. 5, p. 293, 1970; M a-h a d e v a n S., D i 1 1 a r d C. J. a. T a p-p e 1 A. L. A modified colorimetric micromethod for long-chain fatty acids and its application for assay of lipolytic enzymes, Ann. Biochem., v. 27, p. 387, 1969; Roe J. H., T i с k t i n H. E. a. Schneider M. Determination and clinical significance of serum lipase, Enzym. biol, clin., t. v, p. 73, 1966; T i e t z N. W. a. Fiereck E. A. A specific method for serum lipase determination, Clin. chim. Acta, v. 13, p. 352, 1966; W i 1 1 s E. D. Lipases, Advanc. Lipid Res., v. 3, p. 197, 1965.

Т.П. Левчук; Г .М. Могилевский (гистохим.).