КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Общим для современных способов получения первичных трипсинизированных однослойных культур является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой, коллагеназой. В стерильных условиях ткань измельчают, промывают и помещают в р-ре фермента на магнитную мешалку. Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок клеток разводят ростовой средой до оптимальной концентрации (в зависимости от типа клеточных культур от 100 000 до 500 000 клеток на 1 мл среды). После посева в культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro (фаза стабилизации, lag-фаза), затем они начинают активно пролиферировать (фаза логарифмического роста, log-фаза), вступая в стационарную фазу с образованием монослоя (рис. 1).

Разновидностью монослойных культур являются роллерные культуры. Роллерное культивирование клеток позволяет использовать всю внутреннюю поверхность флакона, к-рая омывается средой в результате постоянного вращения флакона с низкой скоростью (0,5—1 об/мин). Чередование жидкой и воздушных фаз, омывающих клетки, создает максимально благоприятные условия для роста клеток и повышает их продуктивность. Роллерное культивирование применимо для первичных культур, диплоидных штаммов, клеток, а также постоянных клеточных линий с выраженными адгезивными свойствами клеточной поверхности. Успех культивирования на роллерах зависит также от состава среды. Наиболее эффективны установки с перфузией среды во вращающихся роллерах.

Существуют количественные методы оценки пролиферативной активности клеток в культуре. Митотическая активность характеризуется числом клеток, находящихся в разных фазах митоза, на 1000 сосчитанных. Значения выражают в промилле. В зависимости от типа клеточных культур и условий культивирования эта величина варьирует. Наибольших значений митотическая активность достигает в фазе логарифмического роста. Благодаря существованию у нормальных клеток феномена контактного ингибирования роста (см.) формирование сплошного монослоя ведет к прекращению клеточной пролиферации. Для получения новых клеточных генераций сформированный монослой трипсинизируют до образования единичных клеток, которые разводят ростовой средой и пересеивают в новые флаконы. Число пассажей у первичных культур ограничено, и по прошествии определенного времени в них развиваются явления неспецифической дегенерации, ведущей к гибели клеток. Смена среды, создание оптимальных условий культивирования не предотвращают этого процесса.

Отдельные клетки в первичных культурах могут давать начало линиям измененных клеток, которые обладают потенцией безграничного роста в культуре. Выведение линий клеток из первичных культур длится в течение нескольких месяцев. Постоянные клеточные линии (рис. 2) характеризуются наследуемыми изменениями клеточной поверхности, которые в целом определяют их большую автономность, меньшее сродство к субстрату по сравнению с исходными клетками первичных культур. В ряде случаев трансформированные клетки утрачивают свойство контактного ингибирования роста, что в свою очередь ведет к формированию фокусов многослойного роста. Клетки клеточных линий имеют, как правило, нестабильный гетероплоидный набор хромосом. Совокупность всех этих особенностей наряду со свойством бесконечного размножения in vitro называют трансформацией. Можноиндуцировать трансформацию клеток с помощью некоторых вирусов и хим. соединений. Другим источником получения постоянных клеточных линий служат злокачественные новообразования (напр., HeLa-линия получена от женщины с плоско-клеточной карциномой шейки матки). Однако не из всех злокачественных новообразований удается получить клеточные линии. Использование метода клонирования клеток позволяет получить генетически однородную линию — клон, являющийся потомством одной клетки (рис. 3).

Из первичных культур нормальных тканей можно выделить диплоидные штаммы клеток, которые являются морфологически однородными культурами. Диплоидные штаммы должны сохранять в процессе пассирования диплоидный набор хромосом, характерный для особи, от к-рой получен штамм. Диплоидные штаммы проходят три фазы развития: стабилизации, активного роста и старения; они имеют продолжительный, но ограниченный срок жизни. Широко известен штамм WI-38 диплоидных клеток легкого эмбриона человека, выведенный Хейфликом и Мурхедом (L. Hayflick, P. S. Moorhead, 1961). Диплоидные штаммы получают методом эксплантации кусочков эмбриональной ткани и посевом взвеси эмбриональных клеток, щадяще обработанных трипсином при t° 4°. Важна исходная посевная концентрация — 10 5 клеток на 1 мл среды и pH 7,2—7,4. Очень важно получение однородной суспензии, т. к. не полностью трипсинизированные кусочки являются причиной раннего старения культуры. Диплоидные штаммы клеток эмбриона человека выдерживают ок. 50 пассажей. Штаммы, полученные из тканей взрослого организма, имеют более низкий пассажный потенциал. Культуры диплоидных клеток человека используют для приготовления следующих вирусных вакцин: полиомиелитной, аденовирусной, коревой, краснушной, оспенной, риновирусной, антирабической, против клещевого энцефалита. Критериями пригодности штаммов диплоидных клеток для производства вакцин являются кариологическая стабильность, отсутствие вирусной, бактериальной, микоплазменной и других контаминаций, отсутствие туморогенной активности при прививке животным. Для использования в практике получения вакцин штаммы на первых пассажах фазы активного роста замораживают и консервируют при температуре жидкого азота.

Кроме использования в вирусологии, диплоидные штаммы клеток широко применяют для изучения действия различных повреждающих агентов на генетический аппарат клетки для исследования ферментных систем клетки, в экспериментах по клеточной гибридизации, для изучения процессов индуцированной трансформации.

Суспензионное культивирование

Метод суспензионного культивирования дает возможность получать большое количество клеток, в частности для производства ферментов и других биологически активных соединений, имеющих научную и практическую ценность.

Метод суспензионного культивирования основан на изменениях свойств клеточной поверхности пересеваемых клеток, которые имеют пониженное сродство к субстрату. При суспензионном культивировании достигается высокая однородность клеток в культуральной среде, длительное поддержание их в логарифмической фазе роста. Наиболее простой способ культивирования — накопительная культура, в к-рой клетки постоянно перемешиваются (с помощью магнитной мешалки) в незаменяемой среде. Скорость перемешивания 200—300 об/мин. Для лимфоцитов требуется более высокая скорость — 600 об/мин. Более эффективное перемешивание достигается при циркуляции клеток в трубках. Без смены среды в суспензионных культурах наблюдаются все фазы роста клеточных культур in vitro: lag-фаза, log-фаза, стационарная фаза и фаза логарифмического отмирания.

Добавление свежих порций среды в аппараты суспензионного культивирования в логарифмической фазе дает возможность поддерживать клетки в этой фазе неограниченно долго. На основе этого наблюдения были разработаны проточные суспензионные системы, в которых скорость поступления среды регулируется скоростью размножения клеток. Проточные суспензионные системы могут быть типа хемостатов, в которых подача среды осуществляется по заданной программе с определенным интервалом времени (на основе полученных параметров клеточного размножения). Более совершенна система турбидостатов, в которых подача среды регулируется на основе фотометрических измерений плотности клеточной суспензии. Для бесперебойной работы хемо- и турбидостатов необходимо поддерживать оптимальные условия культивирования: pH среды, концентрацию O₂ и CO₂, плотность клеток в суспензии, соответствующий состав питательных сред, необходимую температуру.

Суспензионные культуры успешно используют для размножения вирусов гриппа человека и птиц, энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита и т. д. Наиболее широко применяют в суспензионном культивировании среды Хигути, Берча, Нейгла.

Культуры клеток in vivo. Оптимальные условия для жизнедеятельности клеток обеспечиваются организмом. Культивирование клеток и тканей in vivo или пассирование через живой организм осуществляется путем их трансплантации: а) эмбрионам; б) животным с толерантностью к клеткам донора; в) генетически идентичным особям; г) в области, лишенные прямого кровоснабжения (переднюю камеру глаза, мозг, роговицу); д) в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров; е) с применением средств, угнетающих иммунную систему реципиента. Удобной моделью культивирования клеток и тканей является хорион-аллантоисная оболочка куриного эмбриона.

Многие экспериментальные опухоли поддерживают путем серийных пассажей на генетически идентичных животных. Гетеротрансплантацию в переднюю камеру глаза применяют для изучения дифференцировки различных нормальных и опухолевых клеток, а также для культивирования органных культур.

Культивирование клеток в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров (тип АА или НА, с порами, не пропускающими клетки) осуществляется в брюшной полости животных. Клетки в камерах способны не только длительно существовать, но и дифференцироваться. Особенно часто этот метод применяют для ведения органных культур. Перспективны возможности исследования клеток, растущих в диффузионных камерах, методами электронной микроскопии (рис. 4.).

Асцитные опухоли — ряд перевиваемых опухолей животных, которые способны расти в виде свободно взвешенных клеток в экссудате брюшной полости. Некоторые из асцитных опухолей можно культивировать in vitro, что создает уникальную модельную систему для проведения экспериментов, сочетая методы исследования in vivo и in vitro. Наиболее широко в экспериментальной практике используется асцитная форма карциномы Эрлиха; кроме того, получено большое число асцитных форм опухолей у крыс и мышей, которые жизнеспособны в условиях in vitro.

Получение гомо-, гетерокарионов и клеточных гибридов. Методы получения гомо-, гетерокарионов и гибридов соматических клеток in vitro основаны на открытии Барского (G. Barski) с соавт. (1960), обнаружившего, что соматические клетки могут сливаться, образуя жизнеспособные гибриды. Гибридизация соматических клеток проходит несколько этапов. Сначала клетки склеиваются, затем разрушаются клеточные оболочки и образуется цитоплазматический мостик. Полное слияние клеток заканчивается образованием одной общей оболочки. Т. о., получаются двуядерные или многоядерные гомокарионы (если сливаются идентичные клетки) или гетерокарионы (если сливаются клетки разного происхождения). Гомокарионы представляют интерес для изучения поведения многоядерных клеток в культуре. Гетерокарионы нашли применение при решении вопросов регуляции, репрессии и дерепрессии генов. Большое число исследований проведено на гетерокарионах куриных эритроцитов с HeLa-клетками.

Гибриды соматических клеток возникают спонтанно с низкой частотой 10^-6 — 10^-8. Обработка клеток парагриппозным вирусом Сендай (предварительно инактивированным ультрафиолетовым облучением или бета-пропиолактоном) увеличивает частоту слияния до 10^-2—10^-3. С использованием вируса Сендай удается получить гибриды соматических клеток, принадлежащих организмам разных видов, классов (млекопитающие X птицы) и даже разных типов (человек X комар). Для образования гибридов успешно используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который позволил получить слияние клеток от представителей царства растений и животных (растительный протопласт X курица).

Для выделения гибридных клеток после их образования пользуются специальными селективными средами, в которых исходные, родительские, клетки погибают, а выживают только гибриды, отличающиеся от родительских клеток определенным сочетанием маркеров, напр, повышенной резистентностью к действию аналогов оснований ДНК или пониженной потребностью в определенных метаболитах.

Для подтверждения гибридного происхождения выделенных клеток исследуют их Кариотип (рис. 5), определяют присутствие маркерных родительских хромосом, исследуют ферменты и определяют наличие антигенов родительских клеток.

Гибридизация соматических клеток служит основным экспериментальным подходом к картированию генов млекопитающих, в особенности человека. Было обнаружено, что у межвидовых гибридов при культивировании наблюдается предпочтительная утрата хромосом одного из родителей. Так, у гибридов мышь X человек последовательно элиминируют хромосомы человека, что используют для картирования хромосом человека. Развитие методов гибридизации соматических клеток сделало возможным анализ наследования злокачественности на клеточном уровне, изучение механизмов дифференцировки клеток и проблемы регуляции генов.

Кроме описанной гибридизации соматических клеток, разработаны специальные методы получения гибридов для анализа механизмов цитоплазматической наследственности. Получены также гибриды клеток одного типа с отдельными хромосомами из клеток другого типа, с биохим. подтверждением функционирования этих хромосом в гибридной клетке.

Замораживание и хранение клеток при низкой температуре

В конце 19 в. было показано, что бактерии, семена растений и сложные биохимические соединения могут длительно сохраняться при низких температурах. В 50-х гг. 20 в. были сделаны попытки использовать при замораживании клеток вещества, увеличивающие выживаемость,— криопротекторы. Так, Полдж (С. Polge, 1949) обнаружил, что глицерин, добавленный к суспензии клеток, значительно увеличивает их выживаемость. Начиная с 60-х гг. в центре внимания оказался диметилсульфоксид (DMSO). Его широко используют как криопротектор для многих типов клеток. Считают, что главной причиной повреждения клеток при замораживании является повышение концентрации электролитов в клетке или около нее. При температуре ниже 0° в клетках образуются кристаллы льда, которые увеличиваются по мере понижения температуры, соответственно увеличивается в оставшейся среде и концентрация электролитов. Кристаллы льда не образуются при постепенном снижении температуры. Электронно-микроскопические наблюдения свидетельствуют о том, что очень медленное замораживание и быстрое оттаивание вызывают наименьшее повреждение цитоплазматических структур клетки. Для консервирования растущие клетки культуры снимают со стекла трипсином, промывают ростовой средой и помещают в среду замораживания в концентрации клеток 1 млн/мл и более. Среда замораживания — обычная ростовая или поддерживающая среда, содержащая от 2 до 25% сыворотки и криопротекторы: глицерин 5 — 10% или DMSO 5 — 15%. Клетки помещают в специальные стерильные пластиковые или стеклянные ампулы, закрывают или запаивают и начинают охлаждать. До — 20° понижение температуры ведется со скоростью 1° в 1 мин. При замораживании кусочков ткани их измельчают до размера 1 мм3 и проводят аналогичные процедуры. Дальнейшее охлаждение от —20° и до температуры хранения проводят быстро. Хранят замороженные клетки в рефрижераторах с жидким азотом. Предпочтительно хранение в газовой фазе, над жидким азотом, где температура составляет ок. —130°.

Процесс оттаивания должен быть очень быстрым. Ампулы из жидкого азота переносят в водяную баню t° 40°. Как только суспензия полностью оттаивает, ее разводят 1: 10 теплой ростовой средой и рассеивают. Можно предварительно отцентрифугировать клетки и залить свежей ростовой средой. Кусочки промывают и как можно быстрее инокулируют. После 6 мес. хранения культур, замороженных и оттаянных описанным способом, наблюдается 100% выживаемость клеток.

Транспортировка клеток на большие расстояния возможна либо в виде суспензии, либо в виде монослоя в культуральном флаконе, полностью заполненном средой. Возможна транспортировка клеток в замороженном состоянии при температуре кипения жидкого азота в специальных контейнерах и на сухом льду.

Культуры клеток и тканей в радиобиологии

Культуры клеток и тканей широко применяются в радиобиологии. Интерес к ним обусловлен возможностью изучать радиационную патологию клетки, изолированную от влияния других клеточных систем или нейрогуморальных факторов, которые имеют место в организме.

Культуры клеток используют при разработке вопросов механизма действия ионизирующего излучения на клетку (см. «Мишени» теория), проблемы клеточной радиочувствительности, вопросов поражения и восстановления клеток при действии ионизирующих излучений и др. Установлены, напр., закономерности изменения частоты хромосомных аберраций в зависимости от мощности дозы излучения. При относительно больших мощностях дозы излучения (более 0,5—1 р/мин) частота хромосомных аберраций растет с увеличением дозы ионизирующего излучения и составляет примерно 0,15% на каждый рад дозы. В условиях применения малых мощностей доз излучения (0,2—0,0002 р/мин) данная зависимость (доза — эффект) существенно изменяется; рост эффекта (напр., частоты хромосомных аберраций) от дозы ионизирующего излучения выражен тем слабее, чем меньше мощность дозы излучения, что свидетельствует о снижении биол, эффективности ионизирующего излучения. При продолжительном действии малых мощностей доз ионизирующего излучения возникает стабилизация эффекта, при к-рой, несмотря на продолжающееся облучение культур, уже не происходит дальнейшего повышения частоты хромосомных повреждений, хотя суммарные дозы, полученные клеточной популяцией, могут составлять 5000—10 000 р. Уровень стабилизации эффекта в этих условиях различен и пропорционален величине мощности дозы излучения. Наблюдаемые изменения связывают с тем, что в условиях продолжительного действия ионизирующего излучения облучение захватывает ряд поколений клеток. В облучаемой популяции устанавливается равновесие между интенсивностью возникновения лучевых повреждений в клетках и скоростью их репарации.

Использование синхронных культур позволило получить новые данные о действии радиации на жизненный цикл клетки: выявлены значительные колебания радиочувствительности, детально прослежен характер возникновения хромосомных и хроматидных аберраций, обнаружены участки клеточного цикла, ответственные за задержку синтеза ДНК и митоза и т. п.

Например, наибольшая радиочувствительность, как правило, характерна для клеток, находящихся в момент облучения в период митоза (М), тогда как в пресинтетический (G1) или премитотический (G2) периоды они в 2—5 раз более радиорезистентны. В период синтеза ДНК(S) радиочувствительность чаще имеет промежуточное значение, но отмечаются признаки повышенной репаративной способности клеток.

В радиационной генетике приемы культивирования обеспечивают не только возможность приготовления высококачественных препаратов для тонкого хромосомного анализа (метафазные пластинки) различных видов клеток, в т. ч. и редко делящихся (культивирование с фитогемагглютинином), кроме того, культуры различных клеток являются объектом для разносторонних исследований действия радиации на генетические структуры клеток. Они имеют первостепенное значение в исследовании генных трансмутаций и мутаций. С их помощью выявлены биохимические мутанты, устойчивые к лекарственным препаратам, с измененной радиочувствительностью и т. п.

Для диагностики радиационных поражений наибольшее значение пока имеет определение частоты и типа хромосомных аберраций, возникающих в клетках костного мозга и периферической крови (рис. 6).

Культуры клеток находят применение при изучении действия хим. радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Введение различных хим. веществ в питательную среду облученных культур с последующим анализом выживаемости, частоты хромосомных аберраций или иных объективных показателей лучевого поражения клеток позволяет быстро и с достаточной точностью судить о характере и эффективности их действия на клетки (рис. 7).

Имеются, однако, и определенные ограничения использования культур в радиобиологических и иных исследованиях. Они связаны в первую очередь с тем,, что в однослойных культурах удается обеспечивать только размножение клеток, тогда как второй чрезвычайно важный процесс жизнедеятельности клетки — процесс дифференцировки — быстро затухает. Поэтому в радиобиологических исследованиях чаще используют перевиваемые клеточные линии, а не первичные культуры.

Культуры клеток и тканей в онкологии

Культуры клеток и тканей как метод научного исследования широко применяется в современной онкологии. Метод позволяет на клеточном уровне изучать этиол, факторы и патогенетические механизмы процесса малигнизации, биол, особенности и закономерности поведения и взаимодействия нормальных и опухолевых клеток, механизмы действия канцерогенных и противоопухолевых веществ, а также иных хим., физ. и биол, агентов. В системе К. к. и т. возможно культивирование онкогенных вирусов (см.).

В условиях К. к. и т. закономерно воспроизводится феномен канцерогенеза или малигнизации нормальных клеток. Малигнизация клеток в К. к. и т. может происходить под воздействием онкогенных вирусов, хим. канцерогенных веществ, а также без специальных воздействий (спонтанно).

О первых попытках вызвать малигнизацию клеток вне организма сообщил А. Каррель в 1924 г. С этой целью автор использовал вирус саркомы Рауса. Возникновение опухолей на месте прививки обработанных вирусом куриных моноцитов оставило открытым вопрос, является ли развитие опухолей результатом малигнизации клеток in vitro или следствием действия вируса, размножившегося в культуре клеток. В дальнейшем, по мере выделения и изучения иных онкогенных вирусов, было показано их прямое действие на клетки в К. к. и т. Онкогенные вирусы (ДНК- и РНК-содержащие) вызывают в К. к. и т. развитие процесса трансформации, в ходе к-рого клетки претерпевают наследуемые морфол., кариологические, физиол., антигенные и другие изменения. В случаях злокачественной трансформации клетки приобретают способность образовывать при прививке животным опухоли. Наиболее изучено в К. к. и т. действие таких онкогенных вирусов, как вирус полиомы, SV40, аденовирус, вирус саркомы Рауса и др. Некоторые Онкогенные вирусы способны вызывать злокачественную трансформацию культур клеток человека.

Начиная с опытов Фишера (A. Fischer, 1926) проводятся исследования с целью вызывать малигнизацию клеток хим. канцерогенными веществами. М. А. Магат, А. Д. Тимофеевский, Л. Ф. Ларионов и др. после воздействия многоядерными ароматическими углеводородами (1, 2, 5, 6-дибензантрацен, 3,4-бензпирен) наблюдали в культурах появление морфол, изменений, похожих на трансформацию вирусного происхождения. В последующих опытах с канцерогенными веществами, гл. обр. в условиях монослойных культур, разным авторам удалось вызвать наступление злокачественной трансформации. Тем не менее возможность присутствия в клетках латентных, в т. ч. онкогенных, вирусов оставляет открытым вопрос о самостоятельном малигнизирующем действии на клетки хим. канцерогенных веществ.

В 1941 —1943 гг. в лабораториях Гая (G. О. Gey) и Эрла (W. Earle) было установлено, что малигнизация клеток может происходить без специальных воздействий в результате длительного культивирования. Так наз. спонтанная малигнизация наступает в монослойных культурах спустя несколько месяцев после начала культивирования. В культурах наблюдаются признаки трансформации: изменяется морфология, в клетках возрастает число хромосом (гетероплоидия), скорость роста увеличивается. Прививка таких культур животным часто вызывает развитие опухолей. Причины спонтанной малигнизации в К. к. и т. окончательно не изучены. Придается значение факторам питательной среды, отсутствию гомеостатических влияний организма, переносу клеток в специфические условия К. к. и т. и т. д. Имеются сведения об участии в спонтанной малигнизации онкогенных вирусов, микоплазм.

Культуры клеток и тканей являются удобной экспериментальной системой для выращивания и изучения опухолей вне организма.

Первые попытки культивировать (эксплантировать) опухоли человека были предприняты в 1910 г. А. Каррелем и Берроузом (М. Т. Burrows). В 1913 г. П. П. Авророву и А. Д. Тимофеевскому впервые удалось выращивать клетки крови и костного мозга больных лейкозами, а в 1914 г. они эксплантировали несколько сарком человека. Последующие многочисленные исследования эксплантатов опухолей показали, что опухолевые клетки в К. к. и т. могли проявлять признаки тканевой принадлежности, что позволило исследовать гистогенез ряда опухолей человека. Была показана миогенная природа некоторых сарком, уточнен генез новообразований яичников, матки, смешанной опухоли околоушной слюнной железы, малодифференцированных опухолей легкого, новообразований ц. н. с., доказана нейрогенная природа меланом и т. д. Отмеченная способность анаплазированных опухолевых клеток к дифференцировке (созреванию) соответственно их генезу, по мнению А. Д. Тимофеевского, позволяет ставить вопрос о возможности направленного изменения их биол, свойств.

Общий вид некоторых культур клеток опухолей человека представлен на рисунке 8.

Эксплантация опухолей человека преследовала цель получить длительные культуры опухолевых клеток. Однако при выращивании на слое плазмы энергия роста культур ослабевала и клетки гибли. Лишь разработка методики однослойных культур с применением синтетических питательных сред позволила длительно поддерживать рост и размножение опухолевых клеток человека и животных. В условиях монослоя, как и на слое плазмы, продолжительность жизни опухолевых клеток ограничена, если в культуре не наступят изменения, выражающиеся в появлении эпителиоподобных гетероплоидных клеток, которые вытесняют иные клеточные формы (рис. 9). Клетки таких трансформированных культур опухолей способны к неограниченному росту вне организма. В трансформации не исключается роль вирусов, мутагенных веществ, радиации и т. д.

Культуры трансформированных опухолевых и нормальных клеток (клеточные линии) обнаруживают сходство характеристик. Наряду со сходной эпителиоподобной морфологией и субмикроскопическим строением в культурах преобладают клетки с гетероплоидными, чаще околотриплоидными кариотипами. Пролиферативный пул таких популяций высок, а продолжительность клеточного цикла невелика. Трансформированные культуры, утрачивая большинство антигенов, сохраняют видовую специфичность и приобретают культуральный антиген. Опухолевые клетки сохраняют опухолевый антиген, а нормальные при малигнизации — приобретают его. В культурах на фоне пониженного дыхания усиливается гликолиз, увеличивается сродство к глюкозе, изменяется изоэнзимный спектр некоторых ферментов и т. д. Унификация характеристик культур в ряде случаев ставит вопрос о загрязнении (контаминации) одних клеточных культур другими, в т. ч. клетками HeLa, что в каждом случае должно решаться индивидуально.

Первая линия HeLa опухолевых клеток человека была получена в 1951 г. из плоскоклеточного рака шейки матки (Гай с соавт., 1952). Известны и используются в различных исследованиях линии КВ из карциномы полости рта [Игл (Н. Eagle), 1955], H Ер-2 карциномы гортани [Мур (А. Moore) с соавт., 1955], серия клеточных линий «Detroit» [Берман и Сталберг (L. Berman, С. Stulberg), 1957] и др. В нашей стране получены и поддерживаются линия AS из ангиосаркомы (А. М. Ерошкина, 1956), линия ДАПТ из дифференцированной астроцитомы (М. С. Бенюмович с сотр., 1962), линии CaPa, CaVe, CaOv, TuWi из карцином поджелудочной железы, желудка, яичника и опухоли Вильмса (Я. В. Добрынин с сотр.). Описаны десятки линий опухолевых клеток человека и животных, выращиваемые в однослойной культуре (рис. 10), а также линии клеток крови и костного мозга больных лейкозами, поддерживаемые в виде суспензионных культур. Многие поддерживаемые в однослойной культуре линии опухолевых клеток человека являются вариантами линии HeLa.

В К. к. и т. изучены особенности поведения и взаимодействия опухолевых клеток. По данным Аберкромби и Амброуза (М. Abercrombie, E. Ambrose, 1958), поведение опухолевых клеток определяется утратой способности тормозить движение при контакте с другими клетками (см. Контактное ингибирование роста), задерживать вступление в митоз при контакте, а также ориентироваться на поверхности. По Ю. М. Васильеву (1968), в основе патологического поведения лежит не столько неспособность опухолевых клеток к контактному ингибированию движения, сколько нарушенная реакция прикрепления за счет дефекта в организации ламеллярной цитоплазмы — структуры, формирующейся при контакте клеточной поверхности с субстратом (рис. 11).

В К. к. и т. впервые было отмечено снижение и утрата опухолеобразующих свойств длительно культивируемыми опухолевыми клетками. Эти наблюдения касались как клеток, малигнизировавшихся в культуре [Эрл и Сенфорд (К. К. Sanford), 1958], так и полученных непосредственно из опухолей [Фолей (G. Foley), 1965]. Феномен утраты злокачественности в К. к. и т. мало изучен. Предполагается, что снижение и утрата опухолеобразующей способности могут быть обусловлены селекцией более зрелых и менее злокачественных клеток под влиянием факторов среды.

Допускается, что извращение антигенного комплекса вследствие длительного культивирования опухолевых клеток может приводить при трансплантации к развитию тканевой несовместимости.

Культуры клеток и тканей используются для изучения эффектов и механизмов действия различных биол., физ. и хим. агентов. Важно использование К. к. и т. для изучения химиотерапевтических препаратов, применяемых в онкол. клинике, и отбора новых противоопухолевых веществ. Критериями биологического (цитотоксического) действия таких веществ могут быть общее количество и число погибших и жизнеспособных клеток, содержание в культурах белка и нуклеиновых к-т, степень угнетения ферментов, уровень включения клетками радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых к-т, белка и т. д. Культуры клеток и тканей позволяют отбирать потенциально противоопухолевые цитотоксические вещества, в то время как исследование их специфической противоопухолевой активности возможно лишь в опытах на животных.

В К. к. и т. определяют индивидуальную чувствительность опухолей человека к противоопухолевым препаратам с целью последующего лекарственного лечения. Для этого преимущественно используют кратковременные культуры опухолей. Критерии оценки действия препаратов те же, что при отборе цитостатиков. Определение спектра чувствительности опухолей к набору противоопухолевых препаратов (онко-биограмма) позволяет подобрать более эффективный для данного больного противоопухолевый препарат По вопросу о корреляции данных онкобиограммы и результатов последующего лечения нет единого мнения.

Развитие и усовершенствование метода К. к. и т. способствовали его широкому и успешному использованию в различных онкологических исследованиях. Изучены многие биол, свойства и особенности опухолевых клеток, некоторые причины и механизмы канцерогенеза и т. д. Однако ряд ключевых проблем онкологии, таких как спонтанная малигнизация, дифференцировка опухолевых клеток, утрата ими опухолеобразующих и других свойств, еще ожидает своего решения.

Культивирование костного мозга

Костный мозг является незаменимым объектом для изучения процессов пролиферации и дифференцировки клеток вообще и кроветворных клеток в особенности. Он представляет собой гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из пролиферирующих и дифференцирующихся клеток. Дифференцировка протекает в виде ряда последовательных стадий, легко различимых функционально или морфологически. В отличие от большинства других тканей, костный мозг может быть легко получен от живого человека.

История изучения костного мозга в культуре начинается с работы А. Карреля и Берроуза (М. Т. Burrows), культивировавших костный мозг и селезенку в плазменного сгустке еще в 1910 г.

В последующие годы методы культивирования кроветворных тканей развивались и использовались А. А. Кронтовским, А. А. Максимовым, Фишером (A. Fischer), Эфрусси (В. Ephrussi) и др. Несмотря на то, что в этих работах были установлены основные особенности поведения кроветворных клеток в культурах, разработаны методические подходы культивирования костного мозга, уточнены схемы кроветворения (прежде всего А. А. Максимовым), исследователям не удалось получить истинных культур костного мозга, т. е. культур, в которых происходит нарастание массы эксплантированных клеток. Задача эта не решена и к концу 70-х гг. 20 в. При всех используемых методах культивирования кроветворные клетки длительно переживают и самоподдерживаются без существенного увеличения их числа.

Методы культивирования костного мозга можно разделить на две группы — клональные и неклональные.

Клональные методы

Основное назначение таких культур заключается в выявлении различных категорий клеток-предшественников, т. е. клеток, способных проделать достаточное число делений для образования клона из нескольких десятков — тысяч клеток (см. Кроветворение). Необходимые условия для получения клонального роста — среда, обеспечивающая относительную иммобилизацию клеток (чтобы клетки-потомки не мигрировали далеко из зоны пролиферации), низкая плотность посева (чтобы клоны не перекрывали друг друга) и присутствие в среде факторов, способствующих пролиферации и дифференцировке клонообразуюших клеток. Эти условия удалось выполнить для клеток-предшественников всех трех ростков кроветворения.

Культивирование клеток — предшественников гранулоцитов и макрофагов. В качестве иммобилизирующей среды используют агар (конечная концентрация 0,3%) или метилцеллюлозу (конечная концентрация 0,8%). Для роста используют хим. среды, отличающиеся для разных видов животных. Наиболее часто используют среду Мак-Коя 5А, среду 199, РПМИ 1640, среду Игла и др. В бессывороточных средах клоны не образуются, поэтому обязательно добавление 10—30% сыворотки (чаще всего эмбриональной телячьей, плацентарной человеческой и др.). Без добавления экзогенного фактора — колониестимулирующей активности (КСА) колонии не образуются при обычных плотностях посева (1—3 X 10⁵ клеток на 1 мл среды); незначительное число колоний развивается при высокой плотности клеток, порядка 10^6 клеток на 1 мл среды и выше. Как правило, культуры ведут в присутствии экзогенного фактора — колониестимулирующей активности. В качестве последнего используют кондиционированные среды от культур различных клеток и тканей (фибробластов, моноцитов, злокачественных клеток, почек новорожденных животных, легких, плаценты и др.), сыворотки от нормальных животных или животных с лейкозом либо получавших эндотоксин и т. д. Применяют также и фидер (клеточный подслой, кондиционирующий среду). В этом случае фидер обычно культивируют в нижнем слое более плотного агара (0,5%), на который наслаивают клетки костного мозга в мягком агаре (0,3%). Такой вариант метода наиболее часто используют при культивировании костного мозга человека. В этом случае в качестве фидера используют лейкоциты периферической крови в концентрации 106 клеток на 1 мл среды.

Плотность клеток костного мозга при посеве обычно 1—3 X 105 клеток на 1 мл среды. Регистрацию колоний ведут под инвертированным микроскопом после инкубации в течение 7 —14 дней при t° 37° в атмосфере, представляющей смесь 5 — 10% CO₂ с воздухом (газовая фаза). За колонию принимают клеточное скопление, состоящее обычно из более чем 50 клеток; все клеточные скопления меньшей величины называются кластерами. Предполагается, что кластеры образуются более зрелыми клетками, способными проделать в культуре меньшее число митозов. Наблюдаются три типа колоний — компактные (гранулоцитарные), диффузные (макрофагальные) и смешанные (рис. 12).

Культивирование клеток — предшественников эритроцитов. Принципы такого рода культур те же, что и для предшественников гранулоцитов. В качестве поддерживающего субстрата используют плазменный сгусток (10% цитратная плазма крупного рогатого скота) или метилцеллюлозу (агар для этих культур не пригоден). Для возникновения клонов необходимо присутствие в среде эритропоэтина (ок. 0,25 ед/мл). Различают два типа колоний. Один из них — мелкая колония, состоящая из 8—32 клеток. Счет таких колоний осуществляют через 2 — 3 дня после эксплантации. В более поздние сроки клетки в колониях созревают до эритроцитов и лизируются. Через 5 —10 дней культивирования в присутствии более высоких концентраций эритропоэтина (до 10 ед/мл) возникают большие колонии (свыше 32 клеток, обычно — несколько сотен клеток) или очаги из нескольких мелких колоний. Такой очаг получил название бурста (англ. burst-взрыв). Предполагают, что эти типы колоний образуются разными предшественниками. Менее зрелые предшественники продуцируют бурсты, более зрелые — мелкие колонии.

Культивирование клеток — предшественников мегакариоцитов. Эти предшественники образуют колонии магакариоцитов в агаровых культурах в присутствии меркаптоэтанола (конечная концентрация 5 X 10^-5 М). В качестве источника колониестимулирующей активности используют кондиционированную среду культур лимфоцитов селезенки. Длительность культивирования 7 — 10 дней.

Культивирование клеток — предшественников стромальных механоцитов. При культивировании костного мозга в культуре пролиферируют не только кроветворные, но и стромальные клетки. Последние прочно прикрепляются к стеклу и относительно малоподвижны, в связи с чем образование клонов можно наблюдать не только в полужидких, но и в жидких культурах, где клоны образуются в виде прикрепленных ко дну сосуда клеточных скоплений (рис. 13). Такие культуры ведутся в полных средах (химически определенная среда с добавкой 10—30% сыворотки, чаще всего эмбриональной телячьей). Клеточная концентрация при эксплантации 1—3 X 10⁵ клеток на 1 мл среды. Количество среды определяется площадью дна сосуда для культивирования (примерно 1 мл среды с клетками на 4 см²). Колонии считают через 10—14 дней культивирования невооруженным глазом после окраски (напр., гематоксилином) .

Клональные методы культивирования костного мозга используют очень широко; они стали уже обычными методами исследования больных во многих гематологических клиниках мира. С их помощью были получены исключительно важные данные о кроветворной системе. В частности, удалось показать, что в костном мозге и других кроветворных органах содержатся клетки-предшественники, промежуточные между стволовой кроветворной клеткой и морфологически распознаваемыми клетками соответствующих рядов кроветворения. В связи с этим все категории кроветворных предшественников объединяют в отдел коммитированных предшественников, получивший название буферного отдела. Выявлены следующие категории предшественников: клетка — предшественник гранулоцитов и макрофагов, колониеобразующая единица в культуре (КОЕк); ранний эритроидный предшественник, бурстообразующая единица (БОЕэ); поздний эритроидный предшественник, колониеобразующая единица эритроидная (КОЕэ); предшественник мегакариоцитов, колониеобразующая единица мегакариоцитарная (КОЕм); стромальный предшественник, колониеобразующая единица фибробластная (КОЕф). Все категории кроветворных предшественников представляют собой морфологически клетку, промежуточную между лимфоцитом и бластом. При нормальном кроветворении эти клетки пролиферируют и темп их пролиферации регулируется гормонами. Детально охарактеризован только один из таких гормонов — эритропоэтин; являются ли лейкопоэтины и тромбопоэтины регуляторами, экспериментально не доказано. Установлены клеточные циклы предшественников и их потомков в культуре. Обнаружены факторы, стимулирующие пролиферацию колониеобразующих единиц в культуре, и выявлены некоторые костномозговые популяции, способные к продукции этих факторов. Доказано, что при лейкозах могут страдать как клетки-предшественники, так и продуцирующие колониестимулирующую активность клетки. Обнаружены корреляции между течением лейкоза и характеристикой колониеобразующих единиц в культуре и т. д.

Оказалось, что клетки стромальных предшественников при стабильном кроветворении в организме не пролиферируют. Они способны при трансплантации построить строму костного мозга, на к-рую происходит репопуляция кроветворных клеток, и возникает очаг эктопического кроветворения.

В целом использование клональных методов культивирования костного мозга способствовало выявлению новых данных о строении кроветворной системы, о наличии и свойствах ряда категорий клеток-предшественников, о регуляции пролиферации и дифференцировки этих клеток и т. д. Использование этих методов продолжает интенсивно расти.

Неклональные методы культивирования костного мозга

Основная задача этих методов культивирования — получение стабильных длительных культур кроветворной ткани, с постоянной продукцией кроветворных клеток, в т. ч. и стволовых кроветворных клеток,— все еще не решена. При всех существующих методах культуры более или менее быстро истощаются либо в них продолжается рост, но не кроветворных, а стромальных клеток. Однако и в таком виде неклональные культуры широко используют для изучения ряда принципиальных вопросов функционирования костного мозга.

Органные культуры костного мозга. В органных культурах поддерживается органотипический рост ткани, без увеличения клеточной массы эксплантата. В таких культурах костный мозг фрагментом или густой взвесью эксплантируют на подложку (миллипоровые фильтры, различные мембраны и др.), находящуюся на поверхности среды. Питательные вещества диффундируют из среды в эксплантат, а продукты жизнедеятельности последнего диффундируют в среду. Рост на границе жидкой и газовой фаз способствует сохранению органных структур, что удлиняет функционирование культуры. Такая кроветворная ткань, как эмбриональная печень, может поддерживаться в культуре в течение нескольких недель. Состав питательной среды и газовой фазы такой же, как и при клональных методах культивирования.

Культивирование костного мозга в жидких средах. В отличие от органных культур, при культивировании костного мозга в жидких средах используют клеточные взвеси, а не фрагменты кроветворных тканей. Плотность эксплантации — обычно от 0,5 до 2 млн. клеток в 1 мл. Питательную среду меняют по мере закисления, в зависимости от интенсивности роста клеток. Вариантом культур этого рода является система Марбрука, при к-рой костномозговые клетки с небольшим количеством среды (1 мл) помещают в сосуд с дном из целлофановой мембраны. Этот сосуд помещают в колбу с 50 мл питательной среды. Такая система не требует частой смены среды и в то же время обеспечивает достаточную клеточную плотность.

Неклональные методы культивирования кроветворных клеток широко используют для изучения кинетики различных клеточных популяций, для изучения различных биохим. процессов в клетках и механизмов их индукции (напр., синтез гемоглобина в эритроидных клетках), для исследования клеточных дифференцировок и морфофункциональных характеристик различных популяций кроветворных клеток. Важное место занимает изучение кооперативных взаимодействий клеток в культуре, гуморальных факторов регуляции кроветворения и т. д. Продолжаются попытки получения истинной культуры костного мозга с увеличением массы кроветворных клеток.

С помощью неклональных культур изучены клеточные циклы многих категорий кроветворных клеток, исследованы факторы, индуцирующие дифференцировку в нормальных и некоторых лейкозных клетках, создана наиболее чувствительная система определения эритропоэтина, охарактеризованы многие факторы, стимулирующие кроветворение, и др. Получены первые данные о возможности длительного поддержания кроветворения в культуре.

Культивирование костного мозга в диффузионных камерах. При таком методе культивирования костный мозг в виде клеточной взвеси в полной питательной среде помещают в камеру (объем 0,1—0,2 мл) со стенками из миллипорных или, лучше, нуклеопорных фильтров, величина пор которых (0,22 мкм) не препятствует проникновению в камеру питательных веществ и удалению продуктов обмена. В то же время камеры непроницаемы для клеток. Диффузионные камеры помещают внутрибрюшинно животным, обычно мышам. Т. к. камеры непроницаемы для клеток, в т. ч. и для лимфоцитов, выраженной иммунол, реакции против клеток в камере не происходит, и в брюшной полости мышеи можно культивировать клетки любых видов животных и человека. Рост клеток лучше, если камеру помещают в организм облученного реципиента. Обычно культуры исследуют в течение первых 7—9 дней. Если требуется более длительное культивирование, камеры 1 раз в неделю очищают от наросшей снаружи соединительной ткани и переносят к следующему реципиенту. При съеме культур камеру обрабатывают ферментом проназой, к-рая освобождает кроветворные клетки и позволяет перевести их во взвесь для изучения числа, морфол, и функц, особенностей и т. д.

Такой вариант культур наряду с очевидными недостатками (невозможность изучения гуморальных факторов, особенностей питания, природы регуляторов и т. д.) имеет ряд преимуществ — простота, хорошая воспроизводимость, несложность сред, лучшие условия для клеток, что делает метод все более популярным. С его помощью изучены кинетика превращения исходных культур в камерах, направление дифференцировки кроветворных клеток, межклеточные взаимодействия (в двойных камерах, разделенных фильтром) и др.

Проблема культивирования костного мозга находится в стадии активного развития. В перспективе этих исследований — создание метода определения стволовых кроветворных клеток в культуре, создание стабильных культур кроветворных клеток, получение прироста клеточной массы в культурах костного мозга. Решение этих проблем явится одним из важнейших шагов в прогрессе знаний в области нормального кроветворения и механизмов его малигнизации.

Таблица. Краткая характеристика основных культур клеток (по данным отечественной и зарубежной литературы)

— Означает отсутствие данных по этому вопросу.

Библиография: Голубев Д. Б., Соминина А. А. и Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии, Л., 1976, библиогр.; Иранов С. Д. и Хесин Я. Е. Органные культуры в вирусологических исследованиях, М., 1977, библиогр.: Культура нервной ткани, под ред. Ю. М. Жаботинского, М., 1977, библиогр.; Новые методы культуры животных тканей, пер. с англ., под ред. Ю. М. Оленова, М., 1976; Пол Д. Культура клеток и тканей, пер. с англ., М., 1963; Руководство по культивированию нервной ткани, под ред. Б. Н. Вепринцева, М., 1976, библиогр.; Хлопин Н. Г. Культура тканей, Л., 1940; он же, Общебиологические и экспериментальные основы гистологии, Л., 1946, библиогр.; Эфрусси Б. Гибридизация соматических клеток, пер. с англ., М., 1976, библиогр.; Cells and tissues in culture, ed. by E. N. Willmer, v. 1—2, L.—N. Y., 1965; Dulbecco R. Topoinhibition and serum requirment of transformed and untra-nsformed cells, Nature (Lond.), v. 227, p. 802, 1970;HayflickL. a. Moorhead P. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains, Symp. Int. Soc. Cell Biol., v. 3, p. 155, N. Y.—L., 1964; Lavappa K. S. Survey of ATCC of human cell lines for HeLa contamination, In vitro, v. 14, p. 465, 1978; Readings in mammalian cell cultures, ed. by R. Pollack, N. Y., 1975; Tissue cultures, ed. by P. F. Kruse а. М. K. Patterson, N. Y., 1973.

Культуры клеток и тканей в радиобиологии — Бочков H. П. Хромосомы человека и облучение, М., 1971, библиогр.; Корогодин В. И. Проблемы пострадиационного восстановления, М., 1966, библиогр.; Окада Ш. Радиационная биохимия клетки, пер. с англ., М., 1974.

Культуры клеток и тканей в онкологии — Васильев Ю. М. и Маленков А. Г. Клеточная поверхность и реакции клетки, Л., 1968, библиогр.; Тимофеевская Е. А. Оценка действия противоопухолевых препаратов в культуре тканей, Вестн. АМН СССР, № 9, с. 70, 1966; Тимофеевский А. Д. Эксплантация опухолей человека, М., 1947, библиогр.; он же, Длительные культуры ткани и малигнизация клеток, Вестн. АМН СССР, № 11, с. 3, 1964; Франкфурт О. С. Клеточные механизмы химиотерапии опухолей, М., 1976, библиогр.; Шабад Л. М., Колесниченко Т. С. и Сорокина Ю. Д. Трансплацентарный бластомогенез и органные культуры, М., 1975; Advances in tissue culture, ed. by С. Waymouth, Baltimore, 1970; Aktuelle Probleme der Zellzuchtung, hrsg. v. B. Mauersberger, Jena, 1971; Harris M. Cell culture and somatic variation, N. Y., 1964; Human tumours in short term culture, ed. by P. P. Dendy, L.—N. Y., 1976.

Культивирование костного мозга — Лурия E. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах, М., 1972, библиогр.; Чертков И. Л. и Фриденштейн А. Я. Клеточные основы кроветворения (Кроветворные клетки-предшественники), М., 1977; Metcalf D. Hemopoietic colonies, in vitro cloning of normal and leukemic cells, B., 1977, bibliogr.; Metcalf D. a. Moore М. A. S. Haemopoietic cells, Amsterdam — L., 1971; Murray M. R. a. Kopeсh G. A bibliography of the research in tissue culture, 1884 to 1950, v. 1—2, L.—N. Y., 1953.

Т. H. Игнатова, Т. В. Поспелова; В. А. Губин (рад.), Я. В. Добрынин (онк.), И. Л. Чертков, (гем.), составители табл. Т. Н. Игнатова, Т. В. Поспелова.