ТРАНСДУКЦИЯ

ТРАНСДУКЦИЯ (лат. transductio перемещение) — явление переноса генетического материала из одной бактериальной клетки в другую с помощью бактериофагов. Т., при к-рой фаг переносит (трансдуцирует) любой участок генома бактерии, плазмиды или профага, была названа общей (полной), или неспецифической, в отличие от специфической, или локализованной, Т., напр, осуществляемой фагом А, при к-рой могут быть трансдуцированы лишь участки генома бактериальной клетки, прилегающие к сайту (участку) интеграции профага.

Транс дуцирующая способность установлена для ряда умеренных и вирулентных бактериофагов (см.) различных видов бактерий, напр., фагов PI, Т1, 'k, ф 80, 363, Ми, D108 у Escherichia coli, P22 у Salmonella typhimurium, PI у Shigella, фагов Pseudomonas, Staphylococcus, Proteus, Bacillus subtilis. Наиболее изученной является транс-дукция в системах Р1— E. coli, К — E. coli и P22 — Salmonella. Фаги Р1 и Р22 способны осуществлять Т. практически любого бактериального гена (см.), а также геномов (см.) мелких и крупных плазмид (см.) или их фрагментов.

Впервые Т. была описана Циндером (N. D. Zinder) и Ледербергом (J. Lederberg) в 1952 г. в системе фаг Р22 — Salmonella typhimurium. Было обнаружено, что генетический обмен у сальмонелл осуществляется с помощью агента, проходящего сквозь поры стеклянного фильтра и переносящего генетические детерминанты от клеток-доноров к клеткам-реципиентам. Детальное изучение этого агента показало, что он представляет собой умеренный фаг Р22 сальмонеллы, содержавшийся в одном из родительских штаммов в состоянии профага. Т. о., было установлено, что одним из механизмов генетического обмена у бактерий, резко отличающимся от трансформации (см.) и конъюгации (см. Конъюгация у бактерий), является Т.

В 1955 г. Леннокс (Е. Lennox) открыл способность умеренного фага PI E. coli трансдуцировать генетические признаки от клеток-доноров к клеткам-реципиентам. К тому времени E. coli уже стала микроорганизмом, наиболее полно изученным в генетическом отношении, у к-рого были определены места локализации и сцепления многих генетических маркеров (см. Бактерии, генетика бактерий). Наличие таких данных позволило установить, что тесно сцепленные генетические маркеры могут трансдуцироваться совместно, и частота встречаемости такой котрансдукции (сцепленной трансдукции) тем выше, чем ближе маркеры расположены друг от друга. Генетические маркеры, локализованные в разных областях хромосомы, никогда не трансдуцируются совместно.

В 1954—1956 гг. в лаборатории Ледерберга было обнаружено существование специфической, или локализованной, Т. Было установлено, что фаг X, полученный при индукции лизогенного штамма E. coli К12 (см. Лизогения), также способен осуществлять Т., однако он трансдуцирует лишь одну определенную область бактериальной хромосомы — группу галактозных генов (локус Gal) и ген bio, расположенных рядом с хромосомным участком, в к-ром происходит внедрение профага А (сайт att BOB').

Для осуществления Т. в эксперименте используют лизаты донорных культур, полученные при литическом цикле развития бактериофагов после инфицирования клеток штамма-донора или индукции профага из лизогенных клеток штамма-донора. Таким фагом инфицируют культуру лизогенного или нелизогенного штамма-реципиента и высевают бактерии на селективную среду (см. Селективные среды), на к-рой размножаются только клетки, получившие в результате Т. определенный признак штамма-донора. Если штамм-реципиент лизогенен и несет профаг Р22, все клетки-реципиенты выживают при суперинфекции. В том случае, если реципиентом служил чувствительный штамм, транс дуктанты могут образоваться лишь из тех бактерий, у к-рых заражение фагом не вызвало лизиса. Величина отношения числа трансдуцированных колоний к числу фаговых частиц, инфицировавших клетку-реципиент, служит показателем относительной трансдуцирующей активности фаголизата (так наз. трансдукционный тест). Для фагов Р1 и Р22, способных трансдуцировать какой-либо определенный признак донора, напр, способность синтезировать определенную аминокислоту или метаболизировать определенный углевод, трансдукционный тест составляет примерно 10"5. Каждая трансдуцирующая частица фага несет и передает клетке-реципиенту лишь незначительную часть генома клетки-донора, в к-рой она образовалась. Размер ДНК донора, включаемой в трансдуцирующую частицу, ненамного превышает то количество ДНК, к-рое умещается в головке фага.

Специфическая, или локализованная, трансдукция

При специфической Т. способностью переносить часть генетического материала клетки-донора обладают только те препараты фага, к-рые получены в результате индуцирования лизогенных культур. В отличие от фагов Р1 и Р22 препараты фага А, полученные при логической инфекции чувствительных бактерий, совершенно не обладают трансдуцирующей активностью. Помимо того, что включение фрагмента бактериальной хромосомы происходит только при индуцировании профага, трансдуцируется только тот фрагмент хромосомы, к-рый расположен рядом с местом внедрения профага.

При специфической Т. происходит не замещение реципиентного гена, а добавление к геному реципиента трансдуцированного гена с образованием дупликации этого участка хромосомы. Трансдуктанты такого типа получили название трансдук-ционных гетерогенот, или частичных гетерозигот. Отдельные компоненты гетерогеноты назвали экзогенотой (трансдуцированный фрагмент хромосомы донора) и эндогенотой (хромосома реципиента).

При индуцировании профага А в культуре лизогенных гетерозигот по признаку Gal (Gal+lGal~) образуются лизаты, обладающие чрезвычайно высокой трансдуцирующей активностью (примерно половина всех фаговых частиц приобретает способность трансдуцировать признак Gal+ новым реципиентным клеткам Gal-). Эти лизаты получили название «лизаты HFT» (англ. high frequency transduction — высокая частота трансдукции) в отличие от лизатов LFT (англ. low frequency transduction — низкая частота трансдукции), из к-рых исходные гетерозиготные трансдуктанты образуются с частотой всего ок. 10~6 на частицу фага. Лизаты HFT трансдуцируют исключительно гены gal. Образующиеся трансдуктанты гл. обр. представляют собой нестабильные лизогенные гетерозиготы, к-рые при индуцировании УФ-излучением или температурой 42° (в случае термочувствительного мутантного репрессора) вновь дают лизаты HFT.

Исследование лизатов HFT показало наличие в них двух типов фаговых частиц: инфекционных бляшкообразующих, не обладающих трансдуцирующей активностью, и дефектных, не способных образовывать бляшки на газоне культуры, чувствительной к фагу А, и несущих гены gal бактерии-донора. Дефектные gaZ-трансдуцирующие частицы фага обозначают символом \gal. Дефектный фаг \gal из лизатов HFT размножается вегетативно, если вместе с ним в клетке присутствует фаг-помощник, нормальный фаг А, имеющий полный набор генов и способный комплемент ировать недостающие функции дефектного фага. Генетический анализ дефектных фагов kgal показал, что от 1/4 до 1/3 генома таких фагов заменены на область gal бактериальной хромосомы. Недостающие гены являются жизненно важными и относятся к области h в геноме фага А. Недефектные, или активно лизогенные, трансдуктанты Gal+ можно, следовательно, получить только в том случае, если нелизогенные бактерии заражают фагом из лизата HFT с высокой множественностью заражения (5—10 частиц фага на клетку), т. е. так, чтобы существовала высокая вероятность одновременного проникновения в клетку как дефектного трансдуцирующего фага kgal, так и нормального нетрансдуцирующего фага А.

Содержание ДНК у фагов Xgal варьирует весьма значительно. Это свидетельствует о том, что рекомбинационные события, приводящие к неточному исключению профага А из бактериальной хромосомы, могут происходить во многих участках хромосом фага и клетки-хозяина. Неточное исключение профага к может приводить также к возникновению трансдуцирующих фагов kbio, несущих в своем составе ген bio хромосомы бактерии, расположенный с другой стороны участка, где интегрируется профаг к. В этом случае происходит замена бактериальными генами другой части фагового генома, размер к-рой сильно варьирует. Установлено, что максимальные размеры участков фагового генома в левом и правом плечах хромосомы, к-рые могут быть подвергнуты делеции (см.) и заменены генами бактерии, составляют ок. 55 и 21% всей длины ДНК фага к соответственно. Образование трансдуцирующих частиц происходит независимо от известных рекомбинационных систем бактерии и фага, что позволило отнести этот процесс к так наз. незаконной рекомбинации (см.).

Поскольку фаг к внедряется в бактериальную хромосому в сайте att BOB' практически в 100% случаев лизогении, в течение долгого времени были известны лишь два типа специализированных трансдуцирующих фагов к — kgal и kbio. В 1972 г. Симадой [Шимадой (К. Shimada)] и др. был предложен метод интеграции фага к в необычные места на хромосоме, нашедший широкое применение в молекулярной генетике (см.). Метод основан на способности фага к при определенных условиях включаться в различные места хромосомы E. coli и исключаться из нее с захватом соседних бактериальных генов. Необходимым условием применения метода является использование штаммов бактерий E. coli с делецией области предпочтительного сайта интеграции фага к — attk. Направленную интеграцию фага к можно осуществлять, используя селективные методы отбора вторичных лизогенов с профагом, находящимся вблизи нужных исследователю генов. Таким способом в геном лямбдоидных фагов было введено более 300 генов E. coli, составляющих примерно 1/3 ее хромосомы (учитываются только идентифицированые гены).

Способностью осуществлять специфическую трансдукцию характеризуются и другие представители группы лямбдоидных фагов, в частности фаги ф 80 и ф 81.

Неспецифическая, или общая, трансдукция

Для неспецифической Т. не требуется состояния лизогении с внедрением профага вблизи тех бактериальных генов, к-рые должны быть трансдуцированы. Образующиеся трансдуцирующие частицы, по-видимому, вообще не содержат фаговой ДНК.

Для неспецифической Т. характерны следующие особенности: 1) транс-дуцироваться может любой бактериальный ген; 2) включение гена в фаговую частицу может происходить как во время литической инфекции, так и после индуцирования лизогенных клеток на стадии вегетативного фага, а не профага; 3) перенесенный фрагмент хромосомы клетки-донора включается в хромосому клетки -реципиента при участии рекомбинационной системы бактерии, захмещая гомологичный сегмент хромосомы клетки-реципиента; 4) большинство трансдуктантов (по крайней мере, в случае фага Р1), полученных при низкой множественности инфекции, не являются лизогенными и не обнаруживают никаких следов «остаточного» фага.

Каждая трансдуцирующая частица несет и передает клетке-реципиенту лишь незначительную часть генома той клетки-донора, в к-рой она образовалась. Частота котрансдук-ции сцепленных генов тем выше, чем ближе эти гены расположены друг к другу. Максимальное удаление двух генов друг от друга, когда еще возможна котрансдукция (как сказано выше, удаленные гены никогда не трансдуцируются совместно), составляет 2% от общей длины генома

E. coli. Гены, расположенные в отрезке, длина к-рого составляет 0,5% генома, трансдуцируются совместно с частотой, достигающей 50% и более.

В 1965 г. Икеда (H. Ikeda) и Томидзава (J. Tomizawa) попытались выяснить причину различия между свойствами трансдуктантов, возникающих при специфической и при неспецифической Т. Ими было показано, что трансдуцирующие частицы фага Р1 либо совсем не содержат фаговой ДНК, либо содержат ее в очень небольшом количестве. Это открытие позволило объяснить, почему трансдуктанты, возникающие при единичном заражении нелизогенных реципиентов, нелизогенны сами и почему индуцирование лпзогенных трансдуктантов, содержащих профаг Р1, не приводит к образованию лизатов HFT. Это связано с тем, что трансдуцирующие частицы фага Р1 содержат фрагменты бактериального генома, не включенные в состав генома фага. Поэтому они неспособны вегетативно размножаться в клетке-реципиенте даже в присутствии инфекционного генома фага-помощника ii не наделяют клетку-реципиент иммунитетом к суперинфекции фагом Р1.

В Р1-лизате ок. 0,3% всех фаговых частиц обладают трансдуцирую-щей активностью. Полагают, что фрагмент ДНК клетки-хозяина, к-рый может быть включен в трансду-цирующую фаговую частицу, состоит приблизительно из 100 тыс. нуклеотидных пар, что составляет примерно 2,5% длины бактериального генома (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты). Если частота встречаемости трансдуцирующих частиц в фа-го лизате составляет 0,3%, то частота встречаемости частиц, содержащих какой-либо определенный ген клетки-донора, составляет 0,025-0,003, т. е. 7• 10-5. Это довольно хорошо согласуется с тем, что эффективность возникновения трансдуктантов Тгр+ (Тгр — обозначение гена, контролирующего синтез аминокислоты триптофана) при заражении ауксотрофов Тгр~ фагом Р1, размноженным на штамме дикого типа Тгр+, составляет примерно 3-10"5 трансдуктантов на одну адсорбированную частицу фага Р1. Т. о., эффективность интеграции трансдуцирующего фрагмента в данном с-лучае составляет ок. 40%.

Более тщательное изучение судьбы транс дуцирующей ДНК после ее вхождения в реципиентные бактерии показало, что только 7 — 15% трансдуцирующей ДНК оказывается ковалентно связанной с ДНК реципиента. ДНК, остающаяся не связанной, не реплицируется (см. Репликация) и, по-видпмому, представляет собой абортивно трансдуциро-ванную ДНК.

Абортивная трансдукция

Трансдуцированные фрагменты. к-рые не включились в геном реципиента вскоре после переноса, неспособны к репликации: в каждом поколении клетка, содержащая такой фрагмент, передает его только одной из двух дочерних клеток, так что в любой конкретный момент он присутствует только в одной клетке клона. Однако, поскольку такой фрагмент бактериального генома функционально активен, его продукты синтезируются в каждой клетке, через к-рую он проходит, и могут быть переданы ее потомкам цитоплазматически (см. Наследственность цитоплазматическая). В результате у ауксотрофного реципиента, получившего от донора фрагмент, способный возмещать утраченную функцию, абортивная Т. может обеспечить на минимальной среде, не содержащей требуемого фактора роста, размножение, достаточное для образования мелких колоний, четко отличающихся от больших колоний устойчивых трансдуктантов, возникших в результате внедрения трансдуцированного фрагмента в хромосомы клеток реципиентного штамма. Изучение абортивно трансдуцированной ДНК с помощью ультрацентрифугирования (см.) в градиенте плотности сахарозы или хлористого цезия (CsCl2) и электрофореза (см.) в агарозном геле показало, что в отсутствие агентов, к-рые гидролизуют или денатурируют белок, она проявляла свойства кольцевой ДНК, в то время как в присутствии таких агентов абортивно трансдуцированная ДНК не отличалась по седиментационным и электрофоретическим свойствам от линейной ДНК фага Р1. Эти данные позволили сделать вывод, что абортивно транс-дуцированная ДНК существует в клетке в виде кольцевой молекулы ДНК, связанной с белком, природа к-рого еще не установлена. Неизвестно также, имеет ли он вирусное или бактериальное происхождение.

Полагают, что транс дуцирующая ДНК фага Р1 проникает в клетку-реципиент в виде линейной молекулы, т. к. экстрагированная из трансдуцирующих частиц ДНК является линейной. По-видимому, именно линейная ДНК рекомбинирует с хромосомной ДНК, в результате чего образуются стабильные трансдуктанты. Рекомбинационный обмен между трансдуцированным фрагментом и ДНК хромосом клетки-реципиента происходит в течение первого часа после проникновения трансдуцированной частицы в клетку-реципиент. В дальнейшем наблюдают лишь незначительное увеличение количества связанной ДНК. Та часть трансдуцированной ДНК, к-рая образует кольцевые молекулы, защищена от действия нуклеаз (см.) и рекомбинационно обменивается с хромосомной ДНК с очень низкой частотой (не превышающей 10"3 на поколение). Однако если трансдуцирующий фаг подвергнуть воздействию УФ-излу-чения, число абортивных трансдуктантов уменьшается, а число стабильных трансдуктантов увеличивается.

Трансдукция транспозонов и плазмид. Образование трансдуцирующих частиц бактериофагов Р1 и Р22, к-рые содержат только фрагмент бактериальной ДНК, требует разрезания хромосомы клетки-донора на фрагменты, длина к-рых должна соответствовать размеру фагового генома. Однако из этого правила бывают исключения, о чем свидетельствует существование гибридных фагов, несущих в своем составе ДНК фага и бактериальной хромосомы (напр., фаги РНас п Fipro) или плазмиды (фаги FiCm, Pi Тс, PI Km, PICmSmSu, V22Tc и Р22С/?г, несущие гены устойчивости к антибиотикам). Такие гибридные фаги с высокой частотой трансдуцируют соответствующие генетические маркеры путем лизоген-ных конверсий (см. Лизогения). Большинство из гибридных фагов, несущих маркеры устойчивости к антибиотикам (см. Лекарственная устойчивость микроорганизмов), образуется путем внедрения транспозонов (см.) в фаговый геном. Внедрение транспозоиов происходит во время литического развития фага в клетках, содержащих R-плазмиды.

Гибридные фаги, несущие в составе своего генома транспозоны, могут быть нормальными или дефектными в отношении всех функций фага. Внедрение транспозона в фаговый геном ведет к увеличению размеров генома. Если транспозон имеет меньший размер, чем терминальная избыточность генома, появляются недефектные бляшкообразующие фаговые частицы. Если же внедряемая ДНК не короче, чем терминальная избыточность генома, образуется большое число дефектных фагов наряду с небольшим количеством нормальных бляшкообразующих частиц, возникновение к-рых может быть связано с полной утратой транспозона или с утратой его части. Данные об образовании дефектных и недефектных гибридных фагов свидетельствуют о том, что при созревании в фаговые частицы Р1 и Р22 упаковываются стандартные по размеру молекулы ДНК независимо от того, содержат они полный набор фаговых генов или не содержат.

Наряду с Т. частей плазмидных геномов в виде транспозоиов трансдуцирующие фаги способны осуществлять Т. плазмид, отличающихся мол. весом (массой) и свойствами. Крупные плазмиды, размер к-рых превосходит размер фагового генома, трансдуцируются частями, и в этих случаях упаковка и перенос плазмидных маркеров осуществляются точно так же, как в случае Т. хромосомных маркеров. Перенесенные сегменты плазмидной ДНК могут образовывать кольцевые молекулы в клетках-реципиентах и существовать в них в виде автономных, укороченных по сравнению с исходным геномом плазмид. Мелкие плазмиды, имеющие незначительный по сравнению с фаговым геномом размер, могут включаться в состав ДНК фага с помощью сайт-специфической рекомбинации. В этих случаях в клетку-реципиент переносится «ко-интегрированная» структура,объединившая фаговый и плазмидный геномы. Такая структура отличается нестабильностью и часто распадается на два исходных генома. В сайт-специфической рекомбинации обычно участвуют IS-элементы, входящие в состав плазмидных, а иногда и фаговых геномов и кодирующие только те функции, к-рые относятся к транспозиции.

Т. плазмид осуществляется прп участии разных механизмов. Так, если ряд мелких плазмид траисду-цируется фагом Р1 посредством объединения фагового и илазмидного геномов с помощью саит-специфиче-ской рекомбинации, Т. других плазмид, геном к-рых меньше фагового генома (напр., плазмиды R6K и R28K), является г^сА-зависимым процессом. Т. этих плазмид из гесА-доноров примерно в 1000 раз менее эффективна, чем из гес+-доноров. Какая ДНК объединяется с плазмидной ДНК при упаковке в фаговые частицы — не установлено. Однако отделение плазмидной ДНК от присоединенной при упаковке чужеродной ДНК в клетке-реципиенте происходит независимо от геосистемы клетки-хозяина.

Генетический контроль процесса трансдукции и трансдукционный анализ

Образование транс-дуцирующих частиц при неслецифической Т. происходит относительно редко, на его частоту влияет не только выбор фрагментов ДНК, подходящих по размеру для упаковки в фаговую частицу. Были выделены мутанты фага Р22, способные осуществлять неспецифическую Т. с повышенной пли пониженной частотой по сравнению с трансдуцирующей активностью фага Р22 дикого типа. Мутации, приводящие к увеличению трансдуцирующей активности, по-видимому, изменяют специфичность продукта, позволяющего отличать фаговую ДНК от ДНК клетки-хозяина. Идентификация этого продукта позволит понять, каким образом генетический материал бактерии иногда оказывается включенным в фаговый капе ид.

В основе трансдукционного анализа лежит определение частот совместного переноса тесно сцепленных генов бактериальных и плазмидных геномов. Бактериофаг Р1 является особенно перспективным для этих целей, поскольку он способен развиваться в клетках бактерий, принадлежащих к различным видам и родам.

Трансдуцирующие фаги Р1 и Р22, способные осуществлять неснецифп-ческую Т., широко используются для генетического анализа при построении точных генетических карт хромосом и плазмид E. coli и Salmonella typhimurium.

При использовании специализированных трансдуцирующих фагов, несущих различные участки бактериального генома, значительно расширяются методические возможности исследования бактериального генома. Поскольку бактериальные гены включаются в этих случаях в состав фагового генома и реплицируются подобно фаговым генам, такие трансдуцирующие фаги способствуют решению самых разнообразных вопросов молекулярной генетики, напр., они служат источником бактериальной ДНК для последующего клонирования отдельных генов или оперонов (см.) в векторных фагах и плазмидах, используются для амплифликации бактериальных генов с целью увеличения количества продуктов, синтез к-рых кодируется этими генами, используются при картировании бактериальных генов и построении карт участков бактериального генома, для получения мутаций в определенной области бактериального генома, для создания стабильных меродиплоидных штаммов, при исследовании оперонной структуры и регуляции бактериальных генов, для определения местоположения про-моторных участков и направления транскрипции (см.).

Т рансдуцирующие бактериофаги способствуют обмену генетической информацией между бактериями внутри не только одного вида, но и разных видов и родов. Это определяет их роль в эволюции бактерий. Особенно наглядным в этом отношении является перенос с помощью фагов генов лекарственной устойчивости в составе транспозоиов или плазмид, или генов, контролирующих синтез токсинов.

Представления о Т. и образовании специализированных трансдуцирующих фагов позволяют объяснить многие случаи фаговых конверсий. Известно, напр., что токсигенность многих видов бактерий обусловлена фаговой конверсией нетоксигенных бактерий (см. Фаговая конверсия). С этой точки зрения особенно возрастает мед.-биол. значение трансдуцирующих фагов и необходимость их изучения у представителей различных групп микроорганизмов.

Библиогр.: Миндлин С.3. и Ковалев Ю. Н., Трансдуцирующие лямбдоидные фаги с генами Escherichia coli, Генетика, т. 17, «Na 8, с.. 1351, 1981; Стент Г. и Кэлиндар Р. Молекулярная генетика, пер. с англ., с. 346, М., 1981; Xэйс У., Генетика бактерий и бактериофагов, пер. с англ., с. 396, М., 1965; I i d a S., Meyer J., a. A r-b e г W., Cointegrates between bacteriophage PI DNA and plasmid pBR 322 derivatives suggest molecular mechanisms for PI-mediated transduction of small plasmids, Molec.) gen., Genet., v. 184, p. 1, 1981; M i s e K* a. N a k a у a R« Transduction of R plasmids by bacteriophages PI and P22, Distinction between generalized and specialized transduction, ibid., v. 157, p. 131,1977; MorseM. L., Lederberg E. М., a. L e d e r-berg J., Transductional heterogenotes in Escherichia coli, Genetics, v. 41, p. 7 58, 1956, bibliogr.; Z i n d e г N. D, a* Lederberg J, Genetic exchange in Salmonella, J., Bact., v„ 64, p. 679, 1952, bibliogr.

Т. С. Ильина.