ТЕМНОПОЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Области применения Темнопольной микроскопии как с диагностической целью, так и в исследовательской работе — это в основном прижизненное изучение спирохет, трепонем, лептоспир, жгутикового аппарата бактерий и даже отдельных жгутиков, обнаружение крупных вирусов. Так, Темнопольную микроскопию применяют для диагностики возвратного тифа по «феномену нагрузки» (реакция Брусина — Риккенберга), лептоспироза по морфологии лептоспир и реакции агглютинации и лизиса, сифилиса по морфологии трепонем и т. д. В изучении физиологии клетки Т. м. может быть использована для наблюдения за влиянием различных физ.-хим. факторов на структуру цитоплазмы. На рисунке показан внешний вид лептоспиры при Т. м.

Принцип Т. м. заключается в том, что объект освещается косыми лучами или боковым пучком света. При этом в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные объектами, находящимися в поле зрения. Поэтому наблюдатель видит их ярко светящимися на темном фоне. Т. м. позволяет обнаруживать значительно более мелкие микрообъекты, чем микроскопия в светлом поле. При Т. м. невозможно определить точную форму мелких деталей объекта, поскольку темнопольное изображение представляет собой светящийся ореол вокруг объекта.

Впервые Т. м. осуществили в 1902 г. Р. Жигмонди и Зидентопф (F. W. Ziedentopf) с помощью щелевого ультрамикроскопа; объект при этом освещался боковым пучком света, перпендикулярным оптической оси микроскопа. В таком приборе мельчайшие частицы, величина к-рых лежит за пределами разрешающей способности светового микроскопа, становились видимыми благодаря эффекту Тиндаля (аналогично пылинкам, освещенным узким пучком света). Этот метод освещения не нашел применения для изучения биол. объектов, но используется в ультрамикроскопе (см.), предназначенном для исследования коллоидных систем.

В дальнейшем были разработаны различные способы получения эффекта темного поля. В биологической Т. м. применяется преимущественно метод центрального затемнения в конденсоре. Оно может быть достигнуто простым способом — затемнением центральной части обычного светлопольного конденсора путем помещения кружка черной бумаги на его нижнюю линзу или на стекло под конденсором в держателе для фильтров либо с помощью центральной диафрагмы из плотных материалов — картона, металла. Диаметр центрального затемненного участка должен быть таким, чтобы его изображение полностью перекрывало выходной зрачок используемого объектива. Для каждого объектива он подбирается опытным путем.

Более высокое качество изображения может быть достигнуто при применении специальных линзовых и зеркальных параболоид- и кардиоид- конденсоров, особенно кардиоид-конденсора в сочетании с высокоапертурными (до 0,85) иммерсионными объективами. Для получения темнопольного освещения в падающем свете используют эпиконденсоры с кольцевидным зеркалом.

Отечественная промышленность выпускает специальные конденсоры для Т. м.: низкоапертурный (А—0,7) конденсор светлого и темного поля с большим рабочим расстоянием (ОИ-Ю) для работы с объективами малого увеличения и высокоапертурный (А—1,2) конденсор темного поля (ОИ-13) для работы с любыми объективами (с апертурой не выше 0,85).

При Т. м. апертура объектива должна быть ниже, чем апертура конденсора, для того чтобы крайние лучи не могли попасть из конденсора непосредственно в объектив. Для уменьшения апертуры иммерсионных объективов применяют диафрагмы различных типов: либо в виде воронок-вкладышей, либо ирисовые, позволяющие плавно изменять апертуру от 1 —1,25 до 0,7—0,85. Объективы с переменной апертурой, снабженные ирисовой диафрагмой, могут быть использованы как для светлопольной микроскопии, так и для темнопольной. Для увеличения апертуры конденсора н улучшения качества изображения нужно иммергировать конденсор, помещая каплю иммерсионной жидкости между фронтальной линзой конденсора и нижней поверхностью предметного стекла.

Предметные и покровные стекла для Т. м. должны быть абсолютно чистыми, без царапин, поскольку все эти дефекты выявляются при Т. м. и препятствуют наблюдению объектов. Толщина предметных стекол должна быть не более 1,1 мм, покровных — 0,17 мм. При использовании более толстых предметных стекол лучи, выходящие из конденсора, невозможно сфокусировать на препарате, т. к. их пересечение окажется в толще стекла, а в микроскопе будет видно не темное поле с ярко светящимися объектами, а темный круг со светящейся периферией — оптический срез конуса расходящихся лучей. Такая же картина может наблюдаться при использовании слишком тонких предметных стекол (пересечение лучей находится выше плоскости препарата); в этом случае положение может быть исправлено опусканием конденсора.

Для получения хорошего темнопольного изображения необходимо использовать осветители с источниками света, имеющими большую поверхностную яркость и работающими в режиме максимального накала, а также проводить центрировку света, о к-рой можно судить по свечению пузырьков воздуха в препарате (при децентрированном освещении они светятся неравномерно — в виде серпа, а при центрированном — имеют равномерно светящийся ободок).

Темнопольное освещение в микроскопе осуществляется следующим образом: после установки света в светлом поле по Келеру (см. Микроскопические методы исследования) заменяют конденсор на темнопольный. На фронтальную линзу конденсора наносят каплю иммерсионной жидкости (воды, иммерсионного .масла) и поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла с препаратом, находящегося на столике микроскопа. Наблюдая в окуляр, фокусируют на препарат объектив с небольшим увеличением. Вертикальным перемещением конденсора добиваются минимального размера светового пятна. С помощью центрировочного приспособления конденсора выводят световое пятно в центр поля зрения, устанавливают объектив нужного увеличения и дополнительно центрируют конденсор.

Препарат готовят по методу раздавленной капли (см.); толщина слоя жидкости в препарате между предметным и покровным стеклами должна быть минимальной.

Темнопольная микрофотосъемка и киносъемка движущихся объектов (лептоспир, жгутиков) представляет значительные трудности из-за недостаточной яркости изображения. Их преодоление возможно с помощью электронно-оптических и телевизионных усилителей яркости изображения (см. Люминесцентная микроскопия).

В электронной микроскопии также был получен эффект темного поля. Однако этот метод не нашел применения для изучения биол. объектов.

См. также Микроскоп.

Библиография: Аппельт Г. Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., с. 116, М., 1959;

Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б. Микроскопическая техника, с. 37, М., 1957;

Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, М., 1973; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, с. 83, Л., 1969; Ноtani Н. Light microscope study of mixed helices in reconstituted Salmonella flagella, J. molec. Biol., v. 106, p. 151, 1976.

М. Я. Корн.