ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ — ферменты, относящиеся к классу гидролаз: ацетилхолинэетераза (АХЭ; ацетилхолин — ацетилгидролаза; синоним истинная холинэстераза; КФ 3.1.1. 7) и холинэстераза (ХЭ, БуХЭ; ацилхолин — ацилгидролаза; синоним: псевдо-холинэстераза, бутирилхолинэстераза и др.; КФ 3. 1. 1. 8). Холинэстеразы преимущественно катализируют гидролиз карбоновых эфиров холина (см.): (CH3)3N+CH2CH20C(0)R + + Н20 — (CH3)3N+CH2CH2OH + + RGOOH, где R — углеводородный радикал. Биол. роль ацетилхолинэстеразы заключается в быстром гидролитическом расщеплении нейромедиатора ацетилхолина (см.) и участии таким образом в процессе нервно-мышечной передачи нервного импульса (см. Нервная клетка); функция других холинэстераз в организме человека точно не установлена. Активность холинэстераз в сыворотке крови служит дополнительным диагностическим признаком ряда заболеваний. Соединения, угнетающие активность холинэстераз (см. Антихолинэстеразные средства), такие как галантамин (см.), прозерин (см.), физостигмин (см.) и др., используются в медицине в качестве лекарственных средств при лечении глаукомы, для предупреждения и лечения послеоперационной атонии кишечника, мочевого пузыря, для стимуляции родовой деятельности, при миастении и др.

Ацетилхолинэстераза содержится в нервной ткани и в эритроцитах. Другие холинэстеразы обнаружены в сыворотке крови и печени, в слизистой оболочке кишечника, поджелудочной железе.

Впервые активность холинэстеразы была обнаружена в 1926 году в сердце лягушки, а в 1932 году фермент был выделен из сыворотки крови лошади. В 40—50-х годах 20 века было установлено, что высокая токсичность фосфор органических соединений (см.), обладающих свойствами нервно-паралитических отравляющих веществ (см.), обусловлена их ингибирующим действием на холинэстеразу, в молекуле которой они фосфорилируют остаток серина (см.), лишая тем самым фермент возможности связываться с субстратом (см. Фосфорилирование). К ингибиторам холинэстераз относятся карбаминовые соединения (см.) и Xолиномиметические вещества (см.).

Ацетилхолинэстераза с наибольшей скоростью гидролизует ацетилхолин, а также катализирует гидролиз ацетил-р-метилхолина и ацетоксиэтилииперидиния. Катионные фосфорорганические соединения и бис (З-триметиламмоний-5-ги дроке ифенокси)-1,3-пропандийодид (3116 СТ) являются ее ингибиторами. Специфическим субстратом бутирилхолин-эстеразы является бутирилхолин, ингибиторами — диизопропилфтор-фосфат, 10-(1 -диэтиламинопропионил) фенотиазингидрохлорид (ASTRA-1397).

Холинэстеразы обладают тканевой и видовой специфичностью. Они являются простыми белками. Активная поверхность их молекулы имеет эстеразный центр катализа и анионный центр связывания, которые обрамлены гидрофобными областями, определяющими специфичность фермента в отношении субстратов и ингибиторов. При связывании субстрата на активном центре фермента его карбонильная группа через систему водородных связей образует цикл с имидазолом остатка гистидина (см.) и гидроксильной группой остатка серина эстеразного центра холинэстеразы. Перераспределение электронов по этому циклу приводит к ацилированию гидроксильной группы остатка серина. Отщепление ацильной группы протекает с участием воды по аналогичному циклическому механизму. Необратимое ингибирование холинэстераз фосфор-органическими соединениями напоминает механизм гидролиза субстрата ферментом.

Определение активности холинэстераз производят по количеству негидролизованного ацетилхолина, которое измеряют при действии гидроксиламина и хлорного железа FeCl3 с последующим фотометрированием Fe-ацетгидрокеамового комплекса (метод Хестрина), а также по сдвигу величины pH инкубационной смеси, происходящему в результате закисления среды кислотой, образующейся при гидролизе субстрата (метод Мичела и метод Моландера — Фридмана — Ладью); по измерению количества тиохолина, образующегося при гидролизе ацетилтиохолина, с помощью хромогенного реагента 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (метод Эллмана).

Снижение активности холинэстеразы в сыворотке крови служит показателем нарушения белоксинтезирующей функции печени, это наблюдают также при бронхиальной астме, ревматическом полиартрите, инфаркте миокарда, ожогах, травматическом шоке и др. При тиреотоксикозе и некоторых заболеваниях почек активность холинэстеразы в сыворотке крови повышается. Определение активности сывороточной холинэстеразы очень важно при использовании миорелаксантов (см.) типа сукцинилхолина для обеспечения адекватного наркоза (см.), так как у некоторых людей обнаружено существование атипических холинэстераз, неспособных гидролизовать это производное холина, что ведет к так наз. рекураризации, то есть повторному угнетению нервно-мышечного синапса после восстановления его функции к концу операции, клинически проявляющемуся повторной релаксацией и угнетением дыхания. Одним из мероприятий по предупреждению этого грозного осложнения является своевременная декураризация путем введения антихолинэстеразных препаратов.

Реактиваторы холинэстераз. Антагонисты фосфорорганических соединений, способные восстанавливать активность холинэстераз путем де-фосфорилирования молекулы инактивированного фермента, получили название реактиваторов холинэстераз. В химической структуре всех реактиваторов холинэстераз присутствует оксимная группировка (-NOH), которая ответственна за реактивацию фермента, поэтому эти соединения часто для краткости называют просто оксимами. К реактиваторам холинэстераз принадлежат оксимы, содержащие четвертичные ониевые группы (пралидоксимйодид — 2-ПАМ, пралидоксимхлорид, протонам — P2S, дипироксим. тримедоксим — ТМБ-4, токсогонин и др.), и оксимы, не содержащие четвертичных ониевых групп (моноизонитрозоацетон — МИНА, изонитрозин, диэтиксим и др.).

По характеру своего фармакологического действия реактиваторы холинэстераз являются антидотами (см. Антидоты ОВ) фосфорорганических соединений, обладающих антихолин-эстеразным эффектом. Восстанавливая активность холинэстераз в органах, функция которых была нарушена в результате прекращения гидролиза синаптического ацетилхолина, реак-тиваторы холинэстераз способствуют восстановлению синаптической передачи до уровня, совместимого с жизнью. Было установлено, что при создании в организме достаточных концентраций реактиваторов холинэстераз снимался нервно-мышечный блок, вызванный угнетением холинэстеразы, уменьшалась брадикардия, восстанавливалось дыхание, исчезали другие патогенетически значимые нарушения, возникающие при отравлении фосфорорганическими соединениями.

Реактиваторы холинэстераз способны восстанавливать активность как бутирилхолинэстеразы, так и ацетилхолинэстеразы, однако терапевтическое значение имеет только восстановление активности ацетилхолинэстеразы как фермента, ответственного за гидролиз синаптического ацетилхолина.

В зависимости от выраженности центральных и периферических эффектов реактиваторы холинэстераз делят на две группы: преимущественно периферического действия и смешанного действия (центрального и периферического). К первым относятся моно- и бисчетвертичные оксимы, которые из-за низкой липофильности плохо проникают через гема-то-энцефалический барьер (см.) и поэтому не реактивируют или в незначительной степени реактивируют ацетилхолинэстеразу мозга. Третичные оксимы легко проникают через гистогематические барьеры и в равной степени реактивируют холин-эстеразу мозга и периферических нервных окончаний, являясь, таким образом, реактиваторами смешанного действия. Иногда их называют реактиваторами холинэстераз центрального действия, подчеркивая этим их отличие от реактиваторов только периферического действия.

Биохимический механизм действия реактиваторов холинэстераз основан на взаимодействии молекулы оксима с фосфорилированным ферментом. Этот процесс предположительно может протекать в две стадии. На первой стадии реактиватор связывается с фосфорилированной группой ингибированного фермента, на второй стадии происходит упрочение этой связи в результате нуклеофильной атаки оксимом атома фосфора, что приводит к разрыву ковалентной связи между фосфорильной группой и ферментом и восстановлению его активности. Процесс реактивации холинэстеразы происходит в соответствии со следующим уравнением: А“ + НЕР<±А • НЕР-*НЕ+ + АР, где А" — анион оксима, НЕР — фосфорилированный фермент, А-НЕР — комплекс оксима с фосфорилированным ферментом, НЕ — активный фермент, АР — комплекс фосфорильной группы с оксимом. При взаимодействии с фосфорилированной холинэстеразой третичных оксимов, напр, изонитрозина, образование комплекса происходит без предварительного связывания оксима с фосфорилированным ферментом за счет водородных связей или ван-дерваальсовых сил (см. Молекула). При применении четвертичных оксимов в качестве реактиваторов холинэстераз достигается более прочная связь оксима с ферментом, так как сначала он сорбируется на молекуле фермента за счет положительного заряда четвертичного азота оксима и отрицательного заряда анионного центра фермента. Не случайно наиболее активными реактиваторами холинэстераз являются четвертичные соединения, хотя в последнее время найдены довольно активные реактиваторы и среди соединений, не содержащих ониевой группировки (производные оксоимино-уксусной, кетогидроксимовой кислот и др.).

Среди факторов, влияющих на активность реактиваторов холинэстераз, наибольшее значение имеет степень прочности связи фосфор-органического соединения с холинэстеразой и быстрота утраты ферментом способности к реактивации (так наз. старение фермента). Оба эти фактора, обусловленные структурой ингибитора, определяют возможность и степень реактивации фермента. Например, зоман, используемый некоторыми зарубежными исследователями в качестве ингибитора холинэстераз, образует с ферментом трудно реактивируемый комплекс. Существует возможность конкурентного замедления быстро протекающего процесса старения фермента в присутствии некоторых реактиваторов холинэстераз в достаточных концентрациях. Полагают, что в этом отношении бисчетвертичные пиридиниевые соединения (напр., препарат токсогонин) более активны, чем моночетвертичные. Эффективность реактиваторов холинэстераз в отношении физостигмина, севина и других карбаматов сомнительна из-за недостаточно выраженной способности оксимов к декарбамоилированию холинэстераз. Имеются данные, что реактивировать холинэстеразы, ингибированные соединениями типа оксазила (см.), которые не являются карбаматами, практически не удается. Антидотный эффект оксимов может состоять не только из реактивации холинэстераз, но и из их прямого хим. взаимодействия с фосфорорганическими соединениями. Однако это антидотное действие оксимов может проявиться только при условии предварительного взаимодействия реактиваторов холинэстераз с фосфорорганическими соединениями. Полагают, что слагаемым антидотного эффекта некоторых бисчетвертичных пиридиииевых соединений являются их холинолитические (ганглиоблокирующие, курареподобные) свойства. Тем не менее нет достоверных доказательств того, что фармакологическая активность перечисленных видов реактиваторов холинэстераз играет роль в формировании их антидотного эффекта в такой мере, чтобы можно было поставить под сомнение сложившиеся представления о механизме действия этих соединений.

Единственным показанием к клиническому применению реактиваторов холинэстераз является острое отравление фосфорорганическими антихолин-эстеразными веществами. Предпочтительно по возможности раннее внутривенное введение массивных доз веществ, реактивирующих холинэстеразы, так как при этом создаются наилучшие условия для взаимодействия антидота с инактивированной фосфорилированием холинэстеразой (что не исключает применения этих соединений в более поздние сроки). В последнем случае может быть достигнуто хотя и не столь значительное, но все же ощутимое восстановление активности фермента, что может оказаться решающим в борьбе за жизнь пострадавшего. Антидотная эффективность реактиваторов холинэстераз может быть усилена путем комбинирования оксимов разнонаправленного действия (например, сочетанием дипироксима с изонитрозином).

Специфическую терапию реактиваторами холинэстераз проводят под постоянным контролем активности холинэстеразы в сыворотке крови (см. Дипироксим). Восстановление активности фермента на 20—40% считается благоприятным прогностическим признаком. При передозировке реактиваторов могут проявиться побочные эффекты (умеренное снижение АД, тахикардия), которые обычно проходят с отменой препарата.

Поскольку реактивация фермента в условиях острого отравления происходит значительно медленнее, чем нарастают опасные для жизни симптомы, терапию реактиваторами холинэстеразы необходимо проводить на фоне интенсивной атропинизации (2—3 мл 0,1% раствора атропина на каждое введение реактиватора холинэстеразы), обеспечивающей быстро наступающую защиту холино-рецепторов от чрезмерного холинергического возбуждения. Это позволяет выиграть время, необходимое для повышения активности фермента до терапевтически значимых величин.

См. также Отравления, таблица.

Холинэстеразы в судебно-медицинском отношении. Исследование активности холинэстераз используется в судебной медицине для диагностики отравлений антихолинэсте-разными веществами: при попадании в организм в количестве даже 2—3 смертельных доз эти яды в неизмененном виде, как правило, не сохраняются, т. к. они полностью расходуются на реакцию с холинэстеразой.

При судебно-химическом определении активности холинэстераз в тканях оценивают скорость ферментативного гидролиза субстрата (ацетилхолина), предварительно добавленного в инкубационную пробу. При определенных условиях (температура, pH среды и др.) скорость гидролиза ацетилхолина постоянна. После добавления инактиватора (например, трихлоруксусной кислоты) количество оставшегося неразрушенным субстрата определяют биологическими или биохимическими способами.

В судебно-медицинской практике используют также гистохимические методы обнаружения активности холинэстераз. Поскольку посмертные изменения (см.) в течение первых трех суток после смерти оказывают незначительное влияние на активность холинэстераз в тканях, ее снижение по сравнению с нормой имеет большое значение в судебно-медицинской диагностике отравлений антихолинэсте разными веществами. При этом учитывается не только сам факт снижения общей активности холинэстераз, но и сравнивается изменение этой активности в различных тканях, что позволяет определить тип антихолинэстеразного вещества, вызвавшего отравление (см.). Некоторые из таких веществ (фосфакол, изомеркаптофос и др.) в равной степени угнетают активность холинэстераз в различных органах и тканях, другие антихолинэстеразные вещества (армин и др.) преимущественно угнетают активность холин-эстеразы в головном мозге, третьи (октаметил и др.) — преимущественно ингибируют холинэстеразы в периферических тканях.

Исследования холинэстераз проводят иногда при установлении материнства, отцовства и замены детей (см. Материнство спорное, Отцовство спорное). Большое значение при этом имеет обнаружение крайне редкой атипичной формы холинэстеразы.

Библиогр.: Голиков С. Н. и 3аугольников С. Д. Реактиваторы холинэстераз, Л., 1970, библиогр.; Голиков С.Н. и Розенгарт В. И. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества, Л., 1964, библиогр.; Лужников Е. А. Клиническая токсикология, с. 306, М., 1982; Розенгарт В. И. Холинэстеразы, Функциональная роль и клиническое значение, в кн.: Пробл. мед. хим., под ред. В. С. Шапота и Э. Г. Ларского, с. 66, М., 1973; Смусин Я. С. Судебно-медицинская экспертиза отравлений антихолинэстеразными веществами, М., 1968, библиогр.; Томилин В. В. и Гладких А. С. Судебно-медицинское исследование крови в делах о спорном отцовстве, материнстве и замене детей, М., 1981; Холинэстеразы, Активный центр и механизм действия, под ред. Д. X. Хамидова, Ташкент, 1976, библиогр.; Bosk о vie В., MaksimovicM.a.MiniD. Ageing and reaktivation of acetyl cholinesterase inhibited with soman and its thiocholine-like analogue, Biochem. Pharmacol., v. 17, p. 1738, 1968; Handbuch der experi-mentellen Pharmakologie, hrsg. v. A. Heffter, Bd 15, B., 1963; Neurobiology of cholinergic and adrenergic transmitters, ed. by Б. Heldman a. o., v. 7, p. 85, Basel a. o., 1980.

E. В. Розенгарт; С. H. Голиков (реактиваторы холинэстераз), Р. В. Бережной (суд.).