ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Электронная микроскопия — метод морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющий изучать структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) Клетка). Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клинической симптоматики.

Электронная микроскопия все шире применяется для ранней диагностики заболеваний, а также для выявления этиологии инфекционных процессов. Ее используют в онкологии для определения гистогенеза гепатозов (см.) и других заболеваний печени, определить активность процесса и нередко его этиологию.

Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов (см. гистохимии (см.), иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и др. Это позволило значительно расширить информацию, получаемую с помощью электронной микроскопии, наблюдать структурное выражение течения биохимических процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектическое единство структуры и функции.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследования методика такой подготовки может быть различной. Однако непременным условием при любых электронно-микроскопических исследованиях является фиксация тканей или микробов с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существует два принципиально различных способа фиксации — химический и физический; каждый из них имеет различные варианты.

В электронной микроскопии, как правило, используют химическую фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами. Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задач конкретного исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе хим. фиксаторов исходят из их способности коагулировать белки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовокислый калий и др.).

Для исследования берут биопсийный материал или материал от трупа человека или животных вскоре после наступления смерти. Существуют оптимальные сроки взятия различных тканей и клеток, обычно исчисляемые минутами. Чем раньше ткань помещают в фиксатор, тем более достоверные данные получают о прижизненной структуре клеток. Фиксаторы обладают различной скоростью проникновения в ткань; от этого зависит возможная величина объекта исследования. Так, четырехокись осмия и глутаровый альдегид проникают в ткань на 0,1— 0,5 мм примерно за 1—1,5 часа, что позволяет исследовать образец ткани объемом не более 1 мм³. В среднем время фиксации в химических фиксаторах составляет 1 —1,5 часа, но для некоторых тканей оно может быть увеличено до 4 часов или сокращено до 20—30 минут. В отдельных случаях допускается фиксация в течение 1 суток. Наибольшее распространение получила фиксация материала в глутаровом альдегиде с последующей дофиксацией в четырехокиси осмия. Глутаровый альдегид лучше, чем четырехокись осмия, фиксирует белки, но хуже стабилизирует липиды, что и обусловливает использование обоих фиксаторов как дополняющих друг друга.

Для избирательной фиксации отдельных субклеточных структур используют более специфические фиксаторы (перманганат калия, двухромовокислый калий и др.). Качество фиксации в значительной степени зависит от pH и осмотического давления фиксирующего раствора. Оптимальным является pH 7,2—7,4, что соответствует физиологическим параметрам. Поэтому применяют буферные растворы (см.). Чаще применяют фосфатные или какодилатный буферы. Физиологическое осмотическое давление создают путем добавления осмотически активных веществ, например сахарозы или некоторых солей.

Имеется несколько методов химической фиксации: перфузионный, когда фиксатор вводят в ток крови; фиксация на месте, когда фиксатор вводят в ткань до ее иссечения: метод погружения иссеченных кусочков ткани в фиксатор. Для замедления аутолитических процессов, протекающих в иссеченных кусочках ткани до полной их фиксации, последнюю проводят при 2—5°.

После фиксации необходимо осуществить обезвоживание ткани. Этот процесс должен быть относительно быстрым, постепенным и вместе с тем обеспечить максимально полное удаление воды из образца, что достигается проведением подлежащей исследованию ткани через батарею спиртов или ацетонов восходящей концентрации (от 30 до 100%) в течение 1 часа.

Следующим важным этапом подготовки материала для электронной микроскопии является заливка (заключение) тканей в заливочные среды с целью получения блока, обладающего оптимальным сочетанием твердости и эластичности, позволяющим приготовить тонкий срез ткани (толщиной менее 100 нм), через который может пройти электронный луч. Первым заливочным материалом были метелметакрилат и бутилметакрилат. В настоящее время они почти не применяются, так как токсичны и легко возгоняются под пучком электронов, что приводит к выраженным артефактам и загрязнению электронного микроскопа. Наиболее широко для заливки тканей используют эпоксидные смолы, в основном аралдит и эпон, часто применяемые совместно. Менее распространены полиэфирные смолы (вестопал W) и водорастворимые заливочные смеси, из которых чаще пользуются гликольметакрилатом и дуркупаном. Однако ни одна заливочная среда не является химически инертной и в какой-то степени оказывает влияние на ткань; это необходимо учитывать при интерпретации результатов микроскопировання.

В последние годы широкое применение нашла заливка в так наз. компаунды, то есть в смесь определенных веществ: основы (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру прочность и твердость, пластификатора, обеспечивающего эластичность и упругость полимера, инициатора, диссоциирующего с образованием свободных радикалов, ускорителя, который, взаимодействуя с мономером, освобождает дополнительные активные радикалы, и катализатора, способствующего началу реакции полимеризации. В практике обычно используют компаунд, состоящий из основы, отвердителя, пластификатора и катализатора, роль которого может играть ускоритель или инициатор. Имеется достаточно большое количество способов пропитки ткани заливочными средами. Процесс пропитки обычно протекает при комнатной температуре или в термостате при t° 30—48° в течение 15—48 часов. Затем кусочки ткани переносят в маркированные желатиновые капсулы или специальные формы, наполненные заливочной смесью. Для полимеризации смеси капсулы на 48 часов помещают в термостат при t° 60° либо оставляют в течение 24 часов при комнатной температуре, затем на 24 часа их помещают в термостат при t° 48° и еще на 24 часа — при t° 60°. В результате полимеризации образуется блок, обладающий соответствующими свойствами.

Для получения ультратонких срезов толщиной 30—50 нм используются стеклянные или алмазные ножи. Алмазные ножи долговечнее стеклянных, но из-за высокой стоимости они не получили широкого распространения.

К задней стороне ножа прикрепляют специальную ванночку и нож устанавливают на ультратом. В ванночку наливают 10% раствор этилового спирта или 10% раствор ацетона на дистиллированной воде. В подвижном держателе ультратома закрепляют блок с тканью. Резка блока осуществляется за счет поступательного движения стержня держателя, а подъем и опускание держателя относительно режущей кромки ножа обеспечиваются электронной схемой. Обычно вначале изготовляют так называемые полутонкие срезы толщиной 1 мкм, изучая которые, выбирают интересующий исследователя участок. Сориентировав соответствующим образом полутонкий срез и блок, проводят заточку блока с таким расчетом, чтобы на вершине образовавшейся пирамиды находился необходимый участок. Затем изготовляют ультратонкие срезы толщиной 30—50 нм. Из ванночки срезы переносят на металлические сетки.

Для контрастирования срезов применяют вещества с большим атомным весом, такие как соли тяжелых металлов, интенсивно рассеивающие электроны. Ионы некоторых из этих веществ могут образовывать связи с кислородом и присоединяться к фосфатным группам нуклеиновых кислот; другие, особенно уранилацетат, помимо этого, действуют как универсальные красители на белки; свинец связывается с комплексами ткани и осмиевыми фиксаторами. Повышают контрастность и сами фиксаторы. Обычно проводят контрастирование ультратонких срезов или сочетают контрастирование кусочков и ультратонких срезов ткани, после чего их изучают в электронном микроскопе.

Химические методы фиксации и заливка материала имеют ряд недостатков. Так, при их использовании происходят химические изменения макромолекулярной структуры клеток; при фиксации и обезвоживании клетки и ткани теряют некоторые вещества; при взаимодействии ткани, фиксатора и заливочной среды может меняться локализация внутриклеточных структур. Поэтому интенсивно разрабатываются физические методы приготовления ткани для электронной микроскопии и особенно для цитохимии (см.). Большая часть этих методов основана на очень быстром замораживании кусочков ткани.

При использовании метода замораживания—высушивания кусочка ткани помещают в хладоагенты (пропан, изопентан или фреон), охлажденные до t° —150°, и в клетках мгновенно прекращаются обменные процессы. При этом в ткани не успевают образоваться кристаллы льда, и поэтому субклеточные структуры не разрушаются, а вода переходит в стекловидное состояние. Затем в высоком вакууме (10^-6 — 10^-7 мм рт. ст.) происходит сублимация, после чего ткань специальным способом заливают в замороженные метакрилаты, аралдит или вестопал W. Однако не всегда удается достаточно быстро и равномерно заморозить ткань, а следовательно, полностью избежать образования кристаллов льда, которые при повышении температуры повреждают внутриклеточные структуры. Возникают и другие трудности, приводящие к появлению артефактов. Поэтому чаще применяют разновидность этого метода — замораживание—замещение. После замораживания воду, перешедшую в стекловидное состояние, удаляют, помещая ткань в обезвоживающие вещества при низкой температуре. В этих условиях спирт и ацетон мало влияют на структуру клеток.

Метод криоскалывания (замораживания—травления) позволяет избежать возникновения химических реакций при обработке ткани. Фрагменты тканей замораживают в хладоагенте со скоростью, превышающей 1000° в 1 сек. Объект помещают в вакуумную камеру и тем или иным способом раскалывают или разрывают. На поверхность скола наносят платиноуглеродное покрытие (реплику). Затем реплику очищают от органических остатков в растворе сильного окислителя, промывают в воде и помещают на сеточку для электронной микроскопии.

Для исследования поверхности биол. тканей используют методы реплик и оттенения. Наибольшее распространение получил метод приготовления реплик путем напыления в вакуумной камере углерода на поверхность образца ткани. Для контрастирования образовавшейся реплики на нее под острым углом напыляют электронно-плотные вещества (например, платину или платино-иридиевый сплав). При этом количество атомов металла значительно больше на той стороне контуров образца, которая ближе к источнику напыления; при исследовании в электронном микроскопе она выглядит неконтрастной. Противоположная поверхность контуров имеет мало атомов металла; в электронном микроскопе она контрастна и как бы оттеняет неконтрастную поверхность контура. Метод оттенения позволяет рассчитать высоту контуров исследуемого объекта, так как известны угод напыления, длина тени и увеличение, при котором производилось фотографирование реплики в электронном микроскопе.

Для изучения поверхности изолированных клеток и тканей служит сканирующая (растровая) электронная микроскопия. Одним из основных условий приготовления объекта для сканирующей электронной микроскопии является необходимость сохранения соответствующего поверхностного натяжения клеток во избежание их деформации. Поверхность изучаемой ткани промывают сбалансированными изотоническими забуференными солевыми растворами или безбелковыми культуральными средами с pH 7,3—7,4, подогретыми до t° 37°. Для фиксации обычно применяют изотонический раствор глутарового альдегида с последующей дофиксацией четырехокисью осмия. Ткань обезвоживают в спиртах или ацетонах, а затем высушивают методами замораживания—высушивания или перехода критической точки. Последний основан на использовании такого физического явления, как возникновение при определенных условиях критического состояния равновесия пара и жидкости. При этом методе ткань оказывается в газовой среде (то есть высушенной), что позволяет избежать повреждающего действия поверхностного натяжения. Для достижения высоких степеней разрешения. повышают электропроводность объекта, напыляя на него тяжелые металлы — золото, платину, серебро или их сплавы. Применяется также метод ионной бомбардировки в вакууме пластинки металла ионами инертного газа. «Выбитые» атомы металла оседают на поверхности объекта исследования. Для выявления внутритканевых и внутриклеточных структур применяют механические, термические, химические и другие методы.

Для электронной микроскопии микробов применяют сходные методы с учетом особенностей строения микробов, их размеров, осмотического давления и др. Так, особый подход осуществляется при электронной микроскопии вирусов. Изучение структуры вирусов затруднено из-за малых размеров и слабой рассеивающей способности вириона. На первых этапах электронной микроскопии вирусов эта трудность преодолевалась оттенением частиц при испарении тяжелых металлов в вакууме. Вплоть до конца 50-х годов 20 века методика оттенения вирусных частиц была основной при изучении вирусов в суспензиях. Чаще для этой методики использовали уран-238, платину, палладий или сплавы платины с палладием. Наибольшее распространение получил сплав платины с палладием в отношении 4:1. Зная заданный угол оттенения по длине образующейся тени, определяют высоту вирусной частицы и ее диаметр. Оттенение металлами исследуемого объекта при сочетании с криогенными методиками (замораживание—высушивание) позволяет получить важную информацию при изучении структуры вириона изометрических вирусов.

Широкое распространение получила методика негативного контрастирования вирусов с помощью вольфрамофосфорной кислоты (HзPW12O40), которая при подщелачивают едким калием или едким натрием (от значения pH<2,0 до pH 7,0) изменяется и после нанесения препарата на вирус создает зону высокого рассеивания электронов, в результате чего выявляются морфологические признаки вируса.

Развитию знаний о структуре вириона способствовали криогенные методики. Один из простейших вариантов таких методик заключается в следующем: сетки с подложкой и находящимся на ней вирусом после нанесения контрастирующего раствора помещают в сжиженный пропан (t° —150°) или переохлажденный азот (t° < —200°); дальнейшее высушивание образца при t° —100° в глубоком вакууме способствует сохранению трехмерной организации вириона. Исключение в этих условиях деформирующей роли сил поверхностного натяжения воды привело к пересмотру точки зрения, что форма вириона у липидосодержащих вирусов обладает высокой лабильностью. Более сложные криогенные методики, применяемые в электронной микроскопии (например, криоскалывание), также внесли заметный вклад в развитие представлений о структуре вирионов, особенно имеющих липопротеидную оболочку.

Структура генома вирусов изучается с помощью модифицированной в 1959 году Клейншмидтом и Лангом (A. Kleinschmidt, D. Lang) методики оттенения линейных макромолекул тяжелыми металлами, которые испаряются с V-образных катодов под углом в 10—5°.

Условием, позволяющим изучать нуклеиновые кисты, и особенно однонитчатые (поперечный размер 1 — 1,1 нм) у является связывание их с основными белками, так как при этом образующийся нуклеопротеид имеет диаметр до 18 нм в двунитчатых структурах и до 15 нм — в однонитчатых. В качестве такого белка чаще используют цитохром С. Помещенная на подложку нуклеиновая кислота в белковом чехле имеет самый причудливый контур, и возможность увидеть ее на всем протяжении осуществима только в том случае, если во время оттенения металлами будет совершен хотя бы один поворот сетки с объектом для напыления на 360°. Лучшие результаты достигаются при длительном оттенении (до 10 минут) сплавом платины с палладием и многократном поворачивании напыленной сетки на вращающемся столике.

Многочисленные модификации методики Клейншмидта и Ланга позволяют получать данные не только о длине генома, но и изучать степень гомологии генома различных вирусов, локализовать вставку того или иного гена в составе гибридных молекул, исследовать гибридные молекулы нуклеиновых кислот.

Обширная информация о морфогенезе вирусов получена с помощью ультратонких срезов вирусов. Техника получения ультратонких срезов вирусов не отличается от общепринятой.

В последние годы возрастает удельный вес электронной микроскопии как экспресс-метода для диагностики вирусных инфекций. Особенно велика роль метода иммунной электронной микроскопии, позволяющего установить родовую принадлежность вируса.

Иммунная электронная микроскопия сыграла решающую роль на первых этапах исследования инфекционного гепатита (гепатита А), а также вирусных гастроэнтеритов и внесла существенный вклад в изучение гепатита В.

Теоретические основы иммуноморфологии на светооптическом уровне разработаны в 1942 году Кунсом (А. Н. Coons) с сотрудниками, которые впервые показали, что в молекулу антитела можно ввести некоторые вещества, не нарушая существенно ее специфичности (см. Иммунофлюоресценция). Развитие этой идеи позволило в 1959 году Зингеру (S. J. Singer) разработать иммуноморфологический метод на электронно-микроскопическом уровне, основанный на использовании антител, меченных ферритином. Ферритин — белок с высоким содержанием железа, в котором атомы металла организованы в 4 субъединицы, расположенные близко друг к другу, что обеспечивает высокое рассеивание электронов при электронной микроскопии и четкое выявление молекулы. Конъюгация белка с антителом возможна с помощью различных бифункциональных агентов, наибольшее распространение среди которых получили 2, 4-толуендиизоцианат и ксиленметадиизоцианат. Иммунная электронная микроскопия с помощью антител, меченных ферритином, эффективна для выявления экстрацеллюлярных антигенов микробов в инфицированных тканях, в том числе вирусных антигенов на поверхности клетки, а также поверхностных антигенов клетки. Вместе с тем эта методика в ряде случаев не эффективна, например если необходимо исследовать внутриклеточные антигены, антигены микробов внутри клетки, что имеет место, в первую очередь, при вирусных инфекциях. Это обусловлено тем, что молекулярный вес (масса) антител, меченных ферритином, около 800 000, и поэтому прохождение их через плазматическую мембрану клетки невозможно, а антитела, меченные ферритином, проникшие через нее путем эндоцитоза, не вступают в контакт со специфическим антигеном. Поэтому основная масса исследований, связанная с выявлением внутриклеточных антигенов с помощью антител, меченных ферритином, выполнена при разрушении плазматической мембраны путем замораживания—оттаивания или обработки комплементом. Замена ферритина низкомолекулярными соединениями, содержащими ртуть, йод, не нашла широкого применения из-за низкой специфичности метода.

С конца 60-х годов 20 века в иммунологии применяется иммунопероксидазная методика электронной микроскопии для обнаружения антигенов внутри и на поверхности клеток. Пероксидаза хрена, используемая для метки антител, позволяет получить наилучший эффект по сравнению с другими ферментами (фосфатазы, некоторые оксидазы) благодаря более низкому молекулярному весу (около 40 000) и устойчивости к различным гистологическим процедурам. Антитела, меченные пероксидазой, проникают в клетку и связываются с гомологичным антигеном. Конъюгирование антитела с ферментом осуществляется рядом бифункциональных агентов, среди которых наиболее доступным является глутаровый альдегид. После того как произошла связь антитела с соответствующим антигеном, локализация фермента выявляется после контакта его с соответствующим субстратом — бензидином, α-нафтолом, смесью α-нафтола с р-фенилендиамином (нади-реагент). В процессе взаимодействия фермента с субстратом в присутствии перекиси водорода образуется продукт с более выраженной рассеивающей способностью электронов по сравнению с окружающими структурами.

Иммунопероксидазная методика имеет прямой и непрямой варианты модификации, и с их помощью получена важная информация как в цитологии, так и при вирусологических исследованиях. Однако и этот подход не лишен недостатков, среди которых наиболее существенным является массивность образующегося продукта в месте локализации фермента и как следствие этого малая разрешающая способность. Исходя из этого, в 1971 году Курстак (E. Kurstak) рекомендовал использовать конъюгат без последующего внесения субстрата, так как фермент содержит железо и после стандартного окрашивания срезов солями тяжелых металлов (урановыми и свинцовыми) хорошо выявляется в зонах, содержащих гомологичный антиген.

Наиболее эффективна методика иммунной электронной микроскопии вирусов, обработанных иммунной сывороткой. При этом антитела агглютинируют вирионы, что позволяет идентифицировать вирусы в суспензиях с низкой концентрацией вирусов. В простейшем варианте смешивают вирусную суспензию с гомологичной сывороткой. Процедура предусматривает первоначальное инкубирование смеси при t 37° в течение 1 часа, а затем в течение 8—12 часов при t 4°. Для осаждения образовавшихся агрегатов, как правило, достаточно центрифугирования при 10 000 об/мин. Осадок разводят в минимальном количестве дистиллированной воды, суспензию наносят на подложку и осуществляют контрастирование с помощью 1—2% фосфорно-вольфрамовой кислоты.

В другой модификации иммунной электронной микроскопии вирусных суспензий исключают центрифугирование в процессе подготовки препарата. В этом случае сетку с положительно заряженной подложкой помещают на каплю иммунной сыворотки или иммуноглобулина на 15—30 минут при комнатной температуре, избыток сыворотки или иммуноглобулина удаляют, сетку промывают буферным р-ром (pH 7,2), а после этого помещают на каплю вирусной суспензии на 30—60 минут при комнатной температуре. Контрастирование препарата осуществляют любым из применяемых для этих целей препаратов-контрастеров. Иммунная электронная микроскопия в 100 раз повышает чувствительность электронно-микроскопического метода при исследовании вирусных суспензий, что важно при изучении материала с низким титром вируса.

Все шире в иммунной электронной микроскопии используется более сложная, но вместе с тем и более чувствительная модификация, при которой первоначально на подложку адсорбируется белок А (из клеточной стенки Staphylococcus aureus), затем иммуноглобулин G или иммунная сыворотка и только потом вирусная суспензия.

Библиогр.: Боголепов Н. Н. Методы электронно-микроскопического исследования мозга, М., 1976, библиогр.; Гайер Г. Электронная гистохимия, пер. с нем., М., 1974; Гистохимия и электронная микроскопия в клинической и экспериментальной онкологии, под ред. Н. А. Краевского и др., М., 1975; Гольдки Л. С. Основы гистологической техники электронной микроскопии, М., 1963, библиогр.; Гоулдстен Дж. и др. Практическая растровая электронная микроскопия, пер. с англ., М., 1978, библиогр.; Жданов В. М., Азадова Н. Б. и Кульберг А. Я. Маркировка антител ртутноорганическим соединением, Вопр. вирусол., № 10, с. 110, 1962; Пушкарь Н. С. и Капрельянц А. С. Введение в электронномикроскопическую технику для медико-биологических исследований, Киев, 1982, библиогр.; Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ, пер. с англ., под ред. В. И. Петрова, кн. 1—2, М., 1984; Ровенский Ю. А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М., 1979, библиогр.; Стоянова И. Г. и Анаскин И. Ф. Физические основы методов просвечивающей электронной микроскопии, М., 1972, библиогр.; Уикли Б. С. Электронная микроскопия для начинающих, пер. с англ., М., 1975; Ультраструктура опухолей человека, под ред. Н. Т. Райхлина и др., М., 1981; Финеан Дж. Биологические ультраструктуры, пер. с англ.. М., 1970; Шиммельг. Методика электронной микроскопии, пер. с нем.. М., 1972, библиогр.; Ягубов А. С. и Кац В. А. Электронная микроскопия мягких тканей, Новосибирск, 1984; Brenner S. а. Horne R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses, Biochim. biophys. Acta (Amst. ), t. 34, p. 103, 1959; Methods in virology, ed. by K. Maramorosch a. H. Koprowski, V. 5, N. Y., 1971; Roth J. The preparation of protein А-gold complexes with 3 nm and 15 nm gold particles and their use in labelling multiple antigens on ultra-thin sections, Histochem. J., v. 14, p. 791, 1982; Singer S. J. Preparation of an electron-dense antibody conjugate, Nature (Lond.), v. 183, p. 1523, 1959.

См. также библиогр. к ст. Электронный микроскоп.

В. С. Пауков, А. К. Кранчев; С. М. Клименко (вир., имм. ).