БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ (греч. bios жизнь + chemeia химия + люминесценция) — свечение живых организмов, а также их отдельных органов и тканей, возникающее за счет энергии протекающих в них экзотермических химических (биохимических) реакций. Являясь частным случаем люминесценции (см.), Б. подразделяется на биолюминесценцию и сверхслабое свечение.

Биолюминесценция — видимое глазом свечение, свойственное нек-рым живым организмам, испускаемое обычно специализированными системами и характеризующееся высокой эффективностью превращения хим. энергии в свет (напр., свечение светляков, свечение моря или гнилушек, обусловленное жизнедеятельностью микроорганизмов, и др.).

Сверхслабое свечение свойственно, очевидно, всем живым организмам; оно сопровождает ряд процессов, гл. обр. окислительные, протекающие в нормально функционирующем живом организме, в клетках или в отдельных клеточных фрагментах. Основными объектами, на которых было впервые обнаружено явление сверхслабого свечения и свечение которых изучено наиболее подробно, являются корешки злаковых и бобовых растений, листья высших растений, а также ткань печени мышей и крыс.

В отличие от биолюминесценции, сверхслабое свечение характеризуется относительно низкой эффективностью превращения хим. энергии в свет и может быть зарегистрировано только с помощью высокочувствительных оптических приборов. Многообразие типов хим. превращений, обусловливающих биолюминесценцию, различия в интенсивности, спектральном составе и временных характеристиках свечения подтверждают существующие представления о случайном распределении биолюминесценции среди различных представителей живого мира и об отсутствии единой эволюционной линии светящихся организмов.

Интенсивность свечения живых организмов может быть весьма значительной. Наибольшей интенсивностью отличается свечение светляков; напр., у светляка Photinus pyralis интенсивность свечения в начале вспышки соответствует 0,02 св. Различия в спектральном составе отчетливо видны при сопоставлении свечения светляка, излучение к-рого имеет максимум при 565 нм, со свечением бактерий, максимум излучения которых лежит в пределах 470—500 нм, или рачков, испускающих свет в голубой области спектра. Продолжительность свечения различных организмов также варьирует (от длительного, продолжающегося целые часы, относительно постоянного свечения, до коротких вспышек, продолжительность которых у некоторых светляков измеряется долями секунды).

У большинства живых организмов свечение испускает или все тело организма или его специализированные органы. Описаны также организмы (напр., рачок Cypridina hilgendortii), свечение которых возникает вследствие выделения особых веществ во внешнюю среду.

Явление сверхслабого свечения было обнаружено лишь в 20 в. и интенсивно изучается только в последние 10—15 лет. По своей природе сверхслабые свечения делят на:

1) митогенетические излучения;

2) свечения, возникающие при обратных фотохимических реакциях;

3) сверхслабые спонтанные свечения, сопровождающие темновые процессы в клетках и тканях.

Митогенетическое излучение было обнаружено в 1923 г. А. Г. Гурвичем. Это излучение в короткой ультрафиолетовой области, чрезвычайно низкой интенсивности, испускаемое растительными и животными клетками. Излучение регистрировали с помощью биологического детектора, в качестве к-рого применяли культуры дрожжей и клетки корешков лука. Первоначально митогенетическое излучение вызывало большой интерес, т. к. появилась надежда получить с их помощью новую информацию об обменных процессах, протекающих в нормальной клетке; делались попытки использовать митогенетическое излучение для диагностики рака. Однако биологический детектор, с помощью к-рого производилась регистрация излучения, оказался несовершенным, требовал высокого индивидуального мастерства и не гарантировал от возможных ошибок. Попытки обнаружить излучение с помощью каких-либо физ. методов оказались неудачными; не удалось также смоделировать митогенетическое излучение с помощью физ. источников ультрафиолетового света. Все это послужило причиной недоверия многих исследователей к самому факту существования митогенетических лучей и привело практически к полной приостановке подобных исследований.

Свечения при обратных фотохимических реакциях — слабые, затухающие во времени свечения; испускаются зелеными частями растений после предварительного их освещения видимым светом. Спектр этого свечения близок к спектру флюоресценции хлорофилла, а спектр действия сходен со спектром действия фотосинтеза. Форма кривой затухания свечения имеет сложный многокомпонентный характер, меняется в зависимости от интенсивности и спектрального состава действующего света, времени освещения, температуры и не всегда может быть описана математически. Физиологическое состояние фотосинтезирующих организмов также оказывает существенное влияние на интенсивность и форму кривой затухания послесвечения. Послесвечение имеет температурный оптимум (напр., у листьев фасоли при t° 27—30°). При повышении и понижении температуры происходит изменение формы кинетической кривой затухания и снижение интенсивности свечения. Слабое послесвечение листа обнаруживается и при температуре жидкого азота (—170°).

Сверхслабое спонтанное свечение растительных и животных тканей — излучения чрезвычайно низкой интенсивности (10—100 квантов в 1 сек. на 1 см²) с максимумом в видимой части спектра; наблюдается в присутствии кислорода воздуха, возрастает с повышением температуры.

Растения имеют температурный максимум свечения при t° 37—42°, положение к-рого совпадает с моментом начала гибели растения. У термоустойчивых организмов этот максимум лежит при более высоких температурах. Возрастание интенсивности свечения зарегистрировано и при снижении температуры, в момент «холодовой гибели» тканей (эта вспышка интенсивности свечения у морозоустойчивых растений проявляется при относительно более низких температурах). В нормальных условиях свечение удерживается на низком уровне. Гибель организма сопровождается появлением интенсивно развивающегося во времени «деструктивного» свечения.

Основные факторы, усиливающие сверхслабое свечение,— ионизирующая радиация, ионы металлов переменной валентности, перекись водорода, некоторые хим. канцерогены (напр., производные антрацена и др.). Антиокислители (см.), а также соединения, связывающие ионы металлов переменной валентности, цианиды и т. д. приводят к снижению уровня сверхслабого свечения.

Сверхслабое свечение способны испускать не только цельные ткани, их гомогенаты и вытяжки, но и отдельные клеточные фракции (митохондрии, микросомы). Как правило, самой низкой интенсивностью отличается свечение неповрежденных тканей. Свечение липидных фракций, а также субстратов, обогащенных липидами, отличается относительно высокой интенсивностью. Фракции, не содержащие липидов, практически не испускают свечения. Клеточные органеллы в суспензиях сложным образом меняют интенсивность сверхслабого свечения в зависимости от своего функционального состояния и действия внешних факторов.

Сверхслабые спонтанные свечения удалось обнаружить только после создания и внедрения в биологические исследования высокочувствительных малошумных детекторов слабых световых потоков — фотоумножителей (см.). Вначале было зарегистрировано излучение от корней проростков высших растений. Более слабое свечение тканей животных организмов удалось зарегистрировать лишь в 1961 г.

Методы исследования биохемилюминесценции

Основная специфика исследований, связанных с изучением биохемилюминесценции, заключается в необходимости количественной регистрации интенсивности и спектрального состава слабых световых потоков. В связи с этим визуальная регистрация сверхслабого свечения становится невозможной, тем более что глаз имеет еще ряд особенностей, резко ограничивающих возможности его применения: субъективизм, длительная адаптация, узкая область спектральной чувствительности (400—750 нм), непостоянство положения максимума и относительно низкая чувствительность цветного зрения.

Фотографические методы регистрации также не получили широкого распространения гл. обр. вследствие сложности количественной обработки результатов.

Наибольшее распространение получили физические методы регистрации Б. Эти методы основаны на использовании явления фотоэффекта в сочетании с различными электронными методами усиления сигнала. Многие из фотоумножителей обладают высоким коэффициентом усиления (порядка 10⁵—10⁹). Для регистрации сверхслабого спонтанного свечения тканей используют фотоумножители, специально отобранные по минимальным темповым шумам и максимальной интегральной чувствительности (напр., типа ФЭУ-42). Введение схемы интегрирования на выходе позволяет осуществлять непрерывную запись сигнала на ленте самописца.

Выбор методов измерения спектрального состава свечения определяется интенсивностью светового потока. Спектр биолюминесценции — свечения относительно высокой интенсивности — изучают с помощью светосильных монохроматоров и спектрографов. При регистрации сверхслабых свечений приближенную оценку спектра (из-за значительного ослабления светового потока на выходе монохроматора) получают с помощью интерференционных светофильтров или набора цветных стекол с резкими границами пропускания («граничные светофильтры»).

Кинетику и спектральный состав свечений при обратных фотохимических реакциях изучают на приборах, позволяющих осуществлять регистрацию послесвечения спустя контролируемый интервал времени по окончании действия света.

Механизмы процессов, приводящих к появлению биолюминесценции, вследствие их многообразия и сложности изучены еще недостаточно (установлены основные компоненты системы, ответственной за испускание света, выяснены общие закономерности протекающих при этом процессов и т. д.).

У значительного числа видов биолюминесценция возникает вследствие процессов ферментативного окисления особых веществ, называемых люциферинами. Ферменты, катализирующие окисление люциферинов, носят название люцифераз (см.). Как правило, они отличаются чрезвычайно высоким квантовым выходом люминесценции. Для нормального функционирования люциферин-люциферазной системы требуется обычно наличие кислорода, АТФ, ионов металлов переменной валентности и т. д. Люциферины и люциферазы у различных биологических видов не идентичны, не одинаков и состав дополнительных компонентов этой системы, резко отличаются механизмы процессов, приводящих к появлению электронно возбужденных частиц. Кроме того, установлено, что в некоторых случаях биолюминесценция не связана с люциферин-люциферазной реакцией. Напр., свечение медузы Aequorea возникает при взаимодействии специфического белка (экварина) с ионами Ca²⁺, причем в этом процессе свет испускается в отсутствие кислорода.

Свечение при обратных фотохимических реакциях возникает в реакциях окисления кислородом воздуха первичной фотовосстановленной формы хлорофилла (ион-радикала). За послесвечение ответственно несколько независимых реакций. Об этом свидетельствует то, что кривая затухания послесвечения фотосинтезирующих организмов состоит по крайней мере из трех компонентов, отличающихся разными временными характеристиками и чувствительностью к действию ингибиторов. В зеленеющих листьях длительное послесвечение вначале связано с накоплением агрегированных форм хлорофилла-a, затем хлорофилла-b.

Сверхслабые спонтанные свечения возникают вследствие аутоокислительных процессов, протекающих в тканевых липидах. Соединения липидной природы, особенно ненасыщенные остатки жирных кислот и фосфолипидов, наиболее чувствительны к окислению молекулярным кислородом. Высокая склонность этих соединений к аутоокислению, а также их распространенность среди живых организмов объясняет чрезвычайно широкое распространение явления сверхслабого спонтанного свечения.

Механизмы возникновения свечения объясняются теорией свободнорадикального цепного жидкофазного окисления. По этой теории свободные радикалы (см.), ведущие цепь окисления (обычно это перекисные радикалы), могут вступать в реакцию взаимодействия друг с другом (рекомбинация или диспропорционирование). Происходит обрыв двух цепей окисления, образование продуктов реакции в молекулярной форме и освобождение энергии (порядка 100 ккал/моль), достаточной для возбуждения свечения в видимой части спектра. Интенсивность свечения, возникающего при рекомбинации свободных радикалов, пропорциональна квадрату их концентрации в системе.

Следует, однако, учесть, что далеко не вся энергия, освобождающаяся при рекомбинации свободных радикалов, идет на образование света. Вероятность этого процесса очень невелика, порядка одного кванта на 108—1212 актов рекомбинации, чем и объясняется чрезвычайно низкая интенсивность сверхслабых спонтанных свечений.

Механизмы процессов, приводящих к появлению сверхслабого спонтанного свечения, не ограничиваются исключительно реакциями аутоокисления липидов. В литературе имеются данные, указывающие на связь свечения с процессами образования перекисей жирных кислот (из активированных коэнзимом А ненасыщенных жирных кислот), которые образуются в качестве одного из звеньев цепи β-окисления жирных к-т; некоторые данные говорят также о связи свечения растительных организмов с деятельностью аскорбиноксидазы и самоокисляющихся флавопротеинов и какими-то (недостаточно еще конкретизированными) специфическими биохимическими реакциями.

Свечения, излучаемые биологическими организмами, видимо, не играют никакой роли в энергетике живого организма. Непосредственная биологическая роль и значение этих свечений в целом также остаются неясными. Несомненно, однако, что Б. сыграет важную роль в понимании механизмов и путей регулирования сложных биохимических реакций, а также поможет понять молекулярные механизмы генерации света на заключительных этапах этих реакций.

Если биологическая роль Б. продолжает вызывать споры, то ее значение (гл. обр. сверхслабых спонтанных свечений) в медицине и сельском хозяйстве уже сейчас достаточно велико. Оно определяется прежде всего той информацией, к-рую несут эти свечения, о тонких и весьма важных биологических реакциях, протекающих в организме как в норме, так и при ряде патологических процессов.

Прикладное значение свечении оказалось как бы в обратно пропорциональной зависимости от его интенсивности. Так, едва ли не единственным практическим использованием биолюминесценции является возможность определения АТФ в сложных биологических субстратах.

Напротив, сверхслабые спонтанные свечения используются чрезвычайно широко в различных отраслях науки и практики. Практическое значение сверхслабой спонтанной хемилюминесценции основано на том, что с ее помощью легко зарегистрировать уровень радикальной неферментативной реакции окисления в липидах и фосфолипидах мембран клетки, а также установить переход этих реакций со стационарного уровня, характеризующего нормальное состояние, в нестационарный режим аутоускорения (см. Термодинамика), Этот переход является критическим этапом в поражении клетки. Отсутствие специфичности в вышеуказанном механизме поражения позволяет использовать сверхслабую спонтанную хемилюминесценцию для оценки повреждающего действия многих неблагоприятных и токсических факторов, а также для определения резистентности конкретных биологических форм к тем или иным неблагоприятным внешним воздействиям. Разработаны экспресс-тесты определения степени устойчивости растений к температурным, осмотическим и токсическим воздействиям, определения оптимальных условий адаптации, а также степени закалки растений.

Сверхслабое свечение характерным образом меняется при целом ряде патологических процессов и инфекционных заболеваний животных и человека (радиационное поражение, рак, туберкулез, авитаминозы и др.). Эти изменения позволяют характеризовать процесс, а также определять эффективность действия терапевтических агентов; изучение динамики сверхслабого свечения позволяет оценивать степень пригодности консервированных тканей для трансплантации и т. д.

Библиография:

Биолюминесценция, под ред. А. И. Журавлева, М., 1965;

Владимиров Ю. А. Сверхслабые свечения при биохимических реакциях, М., 1966, библиогр.; Владимиров Ю. А. и Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, М., 1972, библиогр.; Тарусов Б. Н. Сверхслабое свечение живых организмов, М., 1972; Тарусов Б. Н., Иванов И. И. и Петрусевич Ю. М. Сверхслабое свечение биологических систем, М., 1967, библиогр.

И. И. Иванов.