АУКСОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Ауксотрофные микроорганизмы, или ауксотрофы (греческий auxö выращивать + trophe питание) — микроорганизмы, характеризующиеся нарушением биосинтеза метаболита, без наличия которого они не способны расти на минимальных питательных средах, содержащих неорганические соединения в качестве источника азота и углеводы в качестве источника углерода. К ауксотрофам относятся также мутанты, нуждающиеся в различных факторах роста, не являющихся необходимыми для исходных штаммов так наз. дикого типа. Штаммы дикого типа, растущие на минимальных средах, называют прототрофами. Общепринятой классификации ауксотрофных микроорганизмов нет; тем не менее в зависимости от потребности в том или ином субстрате ауксотрофные микроорганизмы можно разделить на пять групп. К первой группе отнесены ауксотрофные микроорганизмы, нуждающиеся в какой-либо аминокислоте, ко второй — нуждающиеся в том или ином витамине, к третьей — нуждающиеся в азотистых основаниях, к четвертой — нуждающиеся в сочетании ряда аминокислот, витаминов или азотистых оснований или различных комбинаций их. Мутанты, требующие для своего роста несколько питательных веществ, носят название полиауксотрофных. В пятую группу включены ауксотрофные микроорганизмы, нуждающиеся в ростовых факторах и метаболитах, не относящихся к вышеуказанным веществам, например, в стрептомицине и др.

Различают также ауксотрофные микроорганизмы с абсолютной (не растущие на минимальной среде) и относительной (медленно растущие на минимальной среде и быстро растущие в присутствии определенных метаболитов) потребностью. Отдельное положение занимают температурозависимые ауксотрофные микроорганизмы, которые в одних температурных условиях растут на минимальной среде, а в других требуют для роста дополнительных факторов. Поэтому при идентификации ауксотрофных микроорганизмов необходимо соблюдать стандартные условия опыта — состав среды и температуру выращивания.

Впервые ауксотрофные мутанты микроорганизмов были получены Бидлом и Тейтемом (G. W. Beadle, E. L. Tatum) в 1941 году из штамма грибка нейроспора. Использование двух ауксотрофных мутантов грибка нейроспора, один из которых хорошо развивался в присутствии индола и не рос в присутствии антраниловой кислоты, а другой рос в присутствии обоих компонентов, позволило установить основные стадии биосинтеза триптофана. Анализ ауксотрофных мутантов этого же грибка, нуждающихся в аргинине, позволил также расшифровать этапы биосинтеза аргинина. На различных ауксотрофных мутантах кишечной палочки, не способных использовать неорганический сульфат в качестве источника серы, были определены стадии синтеза метионина и цистеина. На мутантах кишечной палочки, требующих метионина или витамина B₁₂, было выяснено, что витамин B₁₂ участвует в качестве кофермента в одной из стадий биосинтеза метионина. При использовании принципа корреляции последовательности биосинтетических стадий с требованиями различных мутантов к факторам роста были установлены этапы биосинтеза валина, фенилаланина, тирозина, глутаминовой кислоты и других аминокислот и ароматических соединений, азотистых оснований, нуклеотидов и многих других соединений.

Каждый из ауксотрофных мутантов характеризуется нарушением одного или более звеньев биосинтеза необходимого метаболита и вследствие этого нуждается для роста в одном или нескольких веществах. Мутационные изменения влияют на структуру, синтез либо на функцию специфических ферментов, которые контролируют биосинтетические и метаболические процессы бактерий. Устанавливая локализацию ауксотрофных мутаций в геноме и исследуя их влияние на биосинтез того или иного соединения, удалось определить последовательность отдельных реакций в его биосинтезе и сопоставить это с порядком расположения на хромосоме генов, контролирующих эти этапы синтеза. Оказалось, что в ряде случаев последовательность расположения генов в опероне (см.) соответствует последовательности этапов синтеза промежуточных продуктов, а в других случаях такая корреляция отсутствует. Мутации, приводящие к ауксотрофности, изменяют информацию, которая заключена в структурных генах, определяющих специфичность структуры фермента, функцию генетической регуляторной системы или генетическую систему, контролирующую проникновение субстрата в клетку.

Например, при изучении этапов биосинтеза лизина у бактерий было установлено, что аспарагиновая кислота превращается в гомосерин, который является промежуточным продуктом в биосинтезе метионина и треонина. Цепь превращений, ведущая к гомосерину, разветвляется; одна из ветвей приводит к образованию лизина. Если мутация блокирует первый путь — биосинтеза гомосерина, то усиливается синтез лизина, и, наоборот, если мутация обусловливает блок синтеза лизина, то соответственно усиливается синтез гомосерина. Получение таких высокоактивных форм ауксотрофных микроорганизмов представляет важную для народного хозяйства задачу, так как они используются для промышленного получения ряда аминокислот: валина, лизина, триптофана, фенилаланина, тирозина, изолейцина, лейцина, метионина, глутаминовой кислоты и др. Ауксотрофные микроорганизмы, идентичные в отношении потребностей в факторах роста, могут отличаться друг от друга биохимически, когда мутации влияют на различные звенья одной и той же цепи биосинтеза. Однако возможны и другие косвенные механизмы, подавляющие ферментативные реакции, несмотря на присутствие в клетке необходимого для этой реакции фермента.

Частота возникновения естественных ауксотрофных микроорганизмов очень низка, поэтому первым и важным этапом в получении мутантов в достаточном количестве является индукция мутаций путем обработки исходных родительских штаммов различными мутагенами. При выделении ауксотрофных мутантов из популяции пользуются различными методами отбора. Самым простым, но весьма трудоемким методом выделения является случайный отбор ауксотрофных микроорганизмов из большого количества колоний обработанной культуры, высеянной на полноценную среду. Каждую колонию пересевают как на минимальную, так и на полноценную среду. Если на минимальной среде роста нет, а на полноценной среде наблюдается рост, то выделенная колония, возможно, является ауксотрофным мутантом. Среди анализируемых таким способом колоний менее 1% составляют ауксотрофные микроорганизмы. Более эффективным и распространенным является метод отпечатков (реплик) и пенициллиновый метод. Для выделения ауксотрофов методом отпечатков, предложенным Ледербергами (J. Lederberg, E. Lederberg), каждую колонию с помощью репликатора высевают параллельно на две среды: полноценную и минимальную. При сопоставлении чашек отмечают колонии, выросшие на первой и не выросшие на второй, которые затем отсевают и идентифицируют. В отличие от метода отпечатков, при котором вырастают все клетки бактерий, выжившие после обработки сильнодействующим агентом, пенициллиновый (полуселективный) метод оставляет жизнеспособными преимущественно мутировавшие клетки и убивает немутировавшие. Принцип метода основан на том, что пенициллин убивает растущие бактерии, но не повреждает бактерий, не способных к делению в результате отсутствия в минимальной среде определенного необходимого фактора роста, и доля ауксотрофных микроорганизмов в популяции резко увеличивается. Пенициллиновый метод значительно облегчил процедуру выделения ауксотрофных микроорганизмов и применяется по отношению ко всем видам бактерий, чувствительных к антибиотику. Аналогичным образом используют свойства 8-азагуанина и тимидина, меченного тритием. В популяции спорообразующих форм долю ауксотрофных микроорганизмов можно повысить прогреванием культур, выращенных на минимальной среде, так как погибнут только вегетативные клетки проросших прототрофов.

Для идентификации выделенных ауксотрофных мутантов (то есть для определения нуждаемости в тех или иных метаболитах) используют синтетические питательные среды (см.), к которым добавляют факторы роста, и проверяют способность мутантов расти на этих средах. Вначале берут три варианта среды, содержащие смесь всех аминокислот, смесь всех витаминов и смесь азотистых оснований. В качестве добавок используют гидролизат казеина (наличие аминокислот), дрожжевой экстракт (источник витаминов) и гидролизат дрожжевой нуклеиновой кислоты, способный удовлетворять потребность в пуринах, пиримидинах, нуклеозидах и нуклеотидах. Если исследуемый мутант растет на среде, содержащей гидролизат казеина, значит он нуждается для роста в одной из аминокислот. Какая именно аминокислота нужна для роста, легко установить, добавляя к синтетической среде все аминокислоты по отдельности. Таким же образом поступают, если мутанты вырастают на других вариантах сред, содержащих витамины или азотистые основания. Другим методом определения специфических потребностей ауксотрофных мутантов в факторах роста является метод ауксографии, разработанный Бейеринком (M. Beyerinck, 1912). В этом случае изучаемые клоны высевают в чашки Петри вместе с минимальным агаром. После того как агар застынет, на его поверхность наносят различные добавки. Ответ на специфическую добавку определяют по образованию колоний, возникающих в месте нанесения на агар соответствующего фактора роста или их комбинаций. Значительно упрощается методика идентификации ауксотрофных микроорганизмов использованием определенного сочетания различных факторов роста (табл.), добавленных в минимальный агар, по Холлидею (R. Holliday).

Как видно из таблицы, каждая из 12 чашек включает до 6 различных факторов роста, причем каждый метаболит встречается не менее чем в двух чашках. Отмечая колонии, выросшие на различных из 12 чашек, устанавливают, в каких факторах роста нуждается тестируемый клон ауксотрофных микроорганизмов, например, если рост колоний отмечен в 6-й и 10-й чашках, это значит, что мутант нуждается для своего роста в гистидине и т. д. Ауксотрофные микроорганизмы не отличаются стабильностью свойств. Некоторые клоны могут ревертировать к прототрофному типу. Для сохранения стабильности свойств необходимо хранить ауксотрофные мутанты в среде, содержащей достаточное количество необходимых факторов роста. В случае появления разнородности популяции ауксотрофов рекомендуется обработать культуру пенициллином для элиминации прототрофных клонов.

Изучение ауксотрофных микроорганизмов является одним из основных методов расшифровки механизма синтеза ряда метаболитов. Ауксотрофные мутанты бактерий широко применяются в исследованиях по выяснению роли пептидов, пуриновых и пиримидиновых оснований, витаминов и других веществ в жизнедеятельности микроорганизмов, используются при анализе цепи ферментативных реакций, ответственных за процессы люминесценции бактерий, фиксации азота, пигментообразования, развития бактериальных спор в зрелые вегетативные клетки. Ауксотрофные мутанты различных бактерий применяются для исследования механизма бактериального подавления при изучении антагонистических отношений между жизненно важными метаболитами; ряд мутантов используется в качестве тест-микробов для биологического определения различных аминокислот и витаминов. Ауксотрофные микроорганизмы играют большую роль в исследованиях по репродукции бактериофага, в выяснении роли отдельных веществ в процессах взаимодействия фага и клетки. Потребность бактерий в определенных факторах роста (см. Бактериальные факторы роста) является характерной меткой (маркером) и используется при генетическом анализе у бактерий и грибков. Использование маркированных штаммов позволило получить информацию о генетических детерминантах синтеза различных компонентов соматического антигена энтеробактерий и факторах вирулентности некоторых микроорганизмов. Ауксотрофные стрептомицинзависимые мутанты возбудителей бруцеллеза и дизентерии, обладающие резко сниженной вирулентностью, но сохраняющие иммуногенные свойства, используются на практике в качестве живых вакцин для специфической профилактики соответствующих заболеваний. Ряд ауксотрофных штаммов кишечной палочки применяется для индикации некоторых аминокислот в моче и плазме крови людей. В последние годы ауксотрофные микроорганизмы применяются для биодиагностики наследственных аномалий обмена у человека (Д. М. Гольдфарб и сотр.).

Использование ауксотрофных микроорганизмов оказалось особенно эффективным при проведении массовых обследований новорожденных — так называемого скрининга, позволяющего выявить обменные нарушения еще до развития клинических проявлений болезни (фенилкетонурия, гистидинемия, галактоземия и др.). С этой целью капля крови ребенка наносится на фильтровальную бумагу, высушивается и отсылается в лабораторию.

Бумажные диски с пробой крови переносят на агаровую среду, на которую высевают соответствующий ауксотрофный микроорганизм. Рост его указывает на превышение допустимых концентраций аминокислот или углеводов (в зависимости от цели исследования и выбранного штамма), в этом случае проводится повторное обследование ребенка с использованием методов аналитической биохимии.

Библиография: Браун В. Генетика бактерий, пер. с англ., М., 1968; Гольдфарб Д. М. и др. Ауксотрофные штаммы Escherichia coli как индикаторы аминокислот в моче и плазме крови людей, Генетика, т. 4, № 5, с. 88, 1968, библиогр.; Жакоб Ф.и Вольман Э. Пол и генетика бактерий, пер. с англ., М., 1962; Петровская В. Г. Проблема вирулентности бактерий, Л.,1967; Скавронская А. Г. Мутации у бактерий, М., 1967, библиогр.; Тимаков В. Д. и Петровская В. Г. Биология и генетика шигелл Флекснера, М., 1972; Вeаdle G.W. Biochemical genetics, Chem.Rev., v. 37, p. 15, 1945, bibliogr.; Burrows T. W. Genetics of virulence in bacteria, Brit. med. Bull., v. 18, p. 69, 1962; Davis B. D. Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by penicillin, J. Amer. chem. Soc., v. 70, p. 4267, 1948; Hayes W. The genetics of bacteria and their viruses, Oxford, 1968; Holliday R. A new method for the identification of biochemical mutants of microorganisms, Nature (Lond.), v. 178, p. 987, 1956; Lederberg J. Isolation and characterisation of biochemical mutants of bacteria, Meth. med. Res., v. 3, p. 5, 1950; Makela P. H. a. Stосker B. A. D. Genetics of polysaccharide biosynthesis, Ann. Rev. Genet., v. 3, p. 291, 1969, bibliogr.

В. М. Бондаренко.