АНТИГЕН-АНТИТЕЛО РЕАКЦИЯ
Описание
АНТИГЕН—АНТИТЕЛО РЕАКЦИЯ — образование комплекса между антигеном и направленными к нему антителами. Изучение Антиген-антитело реакции имеет большое значение для понимания механизма специфического взаимодействия биологических макромолекул и для выяснения механизма серологических реакций.
Различают две фазы реакции, существенно отличающиеся между собой по механизму и скорости протекания. В первой фазе реакции происходит соединение детерминантной группы Токсин-антитоксин реакция), активация системы комплемента, реакция немедленной гиперчувствительности и пр. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что трудно судить о специфической стадии антиген — антитело реакция на основании существенно иной по механизму второй фазы реакции. В силу этого исследования тонких физических и химических механизмов антиген — антитело реакция осуществляются преимущественно с использованием гаптенов с одной детерминантной группой, которые способны образовывать с направленными к ним антителами только растворимые комплексы.
В случае бивалентных антител (например, антител класса IgG) их реакцию с моновалентным гаптеном (Г) можно записать в виде уравнения: к,
где к1 и к2— соответственно константы скоростей прямой и обратной реакций. В силу того что при реакции гаптена со специфическим антителом не происходит каких-либо видимых превращений, судить о взаимодействии приходится с помощью различных физических и физико-химических методов, основанных на оценке количества связанного гаптена по изменению диффузионного равновесия последнего в присутствии антитела (метод равновесного диализа), либо по изменению оптических свойств гаптена в иммунном комплексе. Величина константы скорости прямой реакции, полученная в эксперименте, достигает 106—107 л•молъ-1сек-1, в то время как обратная реакция значительно медленнее: 1—50 сек-1.
Недостаточное совершенство измерительной техники не позволяет оценить максимальную скорость прямой реакции; из теоретических соображений она могла бы достигать величины 1,5•109 л•моль-1сек-1.
В силу столь больших скоростей прямой реакции соединение антитела с гаптеном завершается уже в процессе смешивания реагентов. Поэтому на практике существенно проще измерять константу сродства (ка=к1/к2), величина которой для ряда систем, рассчитанная с использованием метода равновесного диализа, находится в пределах 105—109 л/моль.
На основании данных о величине ка при различных температурах по уравнению Вант-Гоффа можно вычислить термодинамические параметры реакции гаптен — антитело.
Изменения свободной энергии (дельтаF) при взаимодействии гаптен — антитело имеют порядок величин от —7 до —12 ккал/моль. Это означает, что даже при высоких разведениях степень ассоциации остается еще значительной. Хотя в ряде случаев не отмечались существенные изменения энтропии при формировании комплекса гаптен — антитело (ΔS=0), для многих систем были получены положительные значения ΔS, указывающие на увеличение энтропии, а не на ее уменьшение, что следовало бы ожидать в силу большей упорядоченности системы при образовании иммунного комплекса. Наблюдаемый эффект обусловлен, по-видимому, тем, что гаптен экранирует поверхность активного центра антитела с высвобождением ранее связанных с ней молекул воды. В пользу этого свидетельствуют в свою очередь данные о значительном увеличении парциального специфического объема при реакции гаптен — антитело, полученные с помощью дилатометрии (см.).
До последнего времени многие вопросы, касающиеся механизма антиген — антитело реакция, остаются открытыми. О природе связей между детерминантной группой антигена и группировками в активном центре антитела можно судить на основании оптических свойств связанного гаптена.
Так, с помощью спектрофотометрии и спектрофлуориметрии было установлено для ряда гаптенов (представляющих собой ароматические соединения), что при связывании со специфическим антителом они оказываются в неполярном микроокружении и, следовательно, способны фиксироваться в активном центре за счет гидрофобных взаимодействий. В случае антител к нитрофенильным производным было продемонстрировано образование в активном центре комплекса с переносом электрона между остатком триптофана и гаптенной группировкой. Наконец, не вызывает сомнения возможность образования между аминокислотными остатками в активном центре антитела и детерминантными группами антигенов водородных связей и дальнодействующих электростатических взаимодействий. Все это, однако, не объясняет с достаточной ясностью механизм специфической фазы реакции антиген — антитело. Судя по данным, полученным с помощью физических других методов, в момент связывания антителом детерминантной группы антигена возникает конформационная перестройка собственно активного центра антитела и расположенных вне его участков молекулы. При этом молекула антитела становится более устойчивой к различным денатурирующим воздействиям, равно как и к гидролизу протеолитическими ферментами. Очевидно, в процессе связывания детерминантной группы антигена происходит адаптация к нему активного центра антитела; этот процесс может быть подобен перестройке активного центра фермента при связывании субстрата.
Взаимодействие молекулы антигена с антителом или его активным Fab-фрагментом сопровождается изменениями пространственной структуры молекулы антигена. Так, миоглобин превращается в апомиоглобин при взаимодействии с антителами, направленными к апомиоглобину, а неактивная, полученная от соответствующих мутантов ß-галактозидаза превращается в активный фермент после реакции с антителами к активной форме ß-галактозидазы. В экспериментах с синтетическими полипептидами, использованными в качестве антигенов, было отчетливо продемонстрировано, что антитела к α-спиральной форме полипептида способны стабилизировать эту структуру и, более того, обеспечивать структурный переход пептидов из формы неупорядоченного клубка в α-спираль. Следует подчеркнуть, что наблюдаемые под действием антител структурные переходы в молекуле антигена происходят в процессе первой фазы реакции, а не за счет эффектов, возникающих при агрегации иммунных комплексов. Это несомненно в силу того, что структурные перестройки в антигене вызывают одновалентные активные Fab-фрагменты антител, неспособные обеспечить агрегацию антигена.
В силу структурной гетерогенности антител найденные в эксперименте константы сродства (ка) данного гаптена к антигену представляют собой усредненную величину многих констант, отражающих особенности связывания гаптена различными молекулами антител. Распределение антител по константам сродства описывается кривой Гаусса. Ввиду того что в составе популяции молекул антител всегда присутствуют такие, которые отличаются относительно низкой степенью сродства, число молекул гаптена, связанных на моль бивалентного антитела, достигает величины 2 только при заметном избытке гаптена. Путем преципитации антител к динитрофенильной группе возрастающими количествами специфического антигена удалось получить несколько фракций антител, отличающихся у одного и того же животного по сродству к гаптену на четыре порядка (от 1,0•105 до 1,1•109). При повторных иммунизациях величина ка для более поздних антител возрастает особенно заметно в том случае, когда для иммунизации применяются небольшие количества антигена. Очевидно, антиген соединяется в организме в первую очередь с рецепторами предшественников антителообразующих клеток, отличающихся наибольшим сродством к антигену. При иммунизации большими дозами антигена гетерогенность антител по величине ка возрастает за счет вовлечения в иммунный ответ клеток с антителоподобными рецепторами, характеризующимися низким сродством к антигену и обладающими способностью синтезировать только антитела с низкой степенью сродства.
При оценке кинетических параметров антиген — антитело реакция часто прибегают к определению константы равновесия (к), которую рассчитывают в эксперименте по ингибированию антиген — антитело реакция с помощью специфического гаптена на основании уравнения:
[АгАт] = к [ГАт] [Аг]/[Г],
где каждая величина в скобках означает молекулярную концентрацию вещества. Величина (к) в общем случае близка по значению величине ка. Метод ингибирования реакции преципитации нашел самое широкое применение для оценки структуры детерминантных групп природных антигенов — белков и полисахаридов. В этом случае в качестве гаптенов используют олигосахариды и пептиды, выделенные из природных соединений или полученные синтетическим путем.
Наряду с изучением механизма первой фазы антиген — антитело реакция в течение многих лет идет интенсивное изучение второй фазы реакции и главным образом реакции преципитации (см.). Сейчас не вызывает сомнения, что феномен преципитации связан с образованием решетчатых структур благодаря поливалентной природе антигена и антитела. Теория «решетки», наиболее четко сформулированная впервые Марраком (J. R. Marrack), находит подтверждение в многочисленных фактах, основные из которых следующие: 1) одновалентные гаптены не дают реакции преципитации, в то время как при наличии в молекуле гаптена двух и более детерминантных групп преципитат в присутствии антитела, как правило, образуется; 2) полученные в результате расщепления молекулы антитела одновалентные Fab-фрагменты не преципитируют поливалентный антиген, хотя и соединяются с ним; 3) гибридные искусственно полученные бивалентные F(ab)2-фрагменты антител, каждый из моновалентных фрагментов которых принадлежит различным по специфичности молекулам антител, преципитируют лишь в присутствии обоих антигенов, к которым они направлены, и 4) бивалентные гаптены, содержащие две различные по структуре детерминантные группы, способны образовывать преципитат лишь в присутствии антител к обеим детерминантным группам. Прямые доказательства образования решетчатых структур при формировании преципитата были получены с помощью электронной микроскопии. Схематически эти структуры представлены на рис.1.
Наличием минимум двух валентностей у антигена и антитела не исчерпываются требования, необходимые для формирования иммунных преципитатов, а также для реализации других процессов, протекающих во второй фазе реакции антиген — антитело. Так, хотя антитела, относящиеся к классам IgA и IgE, содержат по два активных центра, они по существу лишены способности участвовать в реакциях преципитации и агглютинации и связывать комплемент в присутствии специфического антигена. По-видимому, основные различия между преципитирующими и непреципитирующими антителами кроются в способности первых образовывать мостики между молекулами антигена либо в силу наперед заданного особенностями структуры большого расстояния между активными центрами (как это имеет место в случае антител IgM-класса), либо при условии достаточной гибкости молекулы антитела, обеспечивающего возможность увеличения расстояния между активными центрами в присутствии антигена. Последнее присуще антителам IgG-класса благодаря вращению Fab-фрагментов, несущих активные центры в отношении Fc-фрагмента (см. Антитела). Так, согласно данным электронной микроскопии в присутствии низкомолекулярного бивалентного гаптена, взаимодействующего с обоими активными центрами антитела, угол между Fab-фрагментами составляет 10°, но может увеличиваться до 180° при соотношении гаптен — антитело (или антиген — антитело), обеспечивающем образование крупных агрегатов, в состав которых входит 4 и более молекул антител. Указанные изменения конформации молекулы антитела IgG-класса представлены на рис. 2. После взаимодействия с антигеном молекула антитела превращается из Y-образной в стержнеобразную с максимально удаленными друг от друга активными центрами, расположенными на дистальных концах Fab-фрагментов.
Необходимость конформационной перестройки антител IgG и IgM классов при участии антигена очевидна и для реализации других процессов, протекающих во второй фазе антиген — антитело реакция, и, в частности, для активации системы комплемента. Эти конформационные изменения затрагивают область молекулы, содержащую специализированный центр для связывания первого компонента комплемента (см. Реакция связывания комплемента). В результате структурной перестройки этого центра, расположенного в Fc-фрагменте (рис.2), по-видимому, возрастает его сродство к первому компоненту комплемента, что необходимо для превращения последнего в активный фермент — CI-эстеразу. Несомненные доказательства изменения третичной структуры молекулы антитела при образовании ими комплексов с антигеном в зоне эквивалентности (то есть при соотношении реагентов, обеспечивающих максимальную преципитацию и связывание комплемента) были получены методом дисперсии оптического вращения. Необходимо подчеркнуть, что увеличение отрицательного левовращения антител наблюдалось именно в составе указанных комплексов и не имело места в комплексах, образованных в избытке антигена. Это показывает, что конформационные изменения в больших по размеру иммунных агрегатах связаны с изменениями структуры участков молекулы антитела, расположенных вне области их активных центров. Таким образом, необходимо констатировать возникновение двух видов конформационных изменений молекулы антитела после се взаимодействия с антигеном. Первые из них, как указывалось выше, возникают непосредственно в области активного центра антитела и в его ближайшем окружении в ходе первой фазы реакции вне зависимости от степени агрегированности иммунного комплекса. Вторые возникают непосредственно во второй фазе реакции в результате формирования агрегатов, включающих не менее двух—четырех молекул антител, и сопряжены со структурной перестройкой удаленных от активного центра областей молекулы антитела, в частности его Fc-фрагмента.
Значительный интерес представляет вопрос о диссоциации комплекса антиген — антитело, который включает в себя проблему обратимости конформационных изменений молекулы антитела, сопровождающих процесс ее взаимодействия с антигеном. Выше уже отмечалось, что обратная реакция антиген—антитело протекает значительно медленнее прямой. В зоне эквивалентности в состав иммунного комплекса вовлекаются целиком как антиген, так и антитело, в силу чего практически ощутимой диссоциации при этом не наблюдается. Однако диссоциация иммунного комплекса в относительно мягких условиях все же возможна уже хотя бы потому, что между партнерами реакции возникают лишь нековалентные взаимодействия. Можно выделить два основных пути, с помощью которых может быть частично или полностью разделен уже сформировавшийся комплекс антиген — антитело. Первый состоит в вытеснении антител избытком антигена (гаптена), а второй — в воздействии на иммунный комплекс внешних факторов, приводящих к разрыву связей (уменьшению сродства) между антигеном и антителом.
Уже при промывании иммунного преципитата физиологическим раствором из его состава можно выделить постоянно уменьшающиеся количества антител и лишь следовые количества антигена. Процесс диссоциации можно записать в форме уравнения:
где n и m соответствуют числу молекул Аг и Ат в комплексе и числу свободных молекул Ат.
Эффективность диссоциации иммунного комплекса существенно возрастает в присутствии большого избытка антигена (гаптена). На практике для этой цели используют моновалентные гаптены, характеризующиеся относительно небольшой степенью сродства к антителам и способные вытеснять из комплекса в первую очередь антитела с относительно низким сродством к антигену. Естественно, антитела элюируются в форме комплекса с гаптеном. Последний в силу относительно низкого сродства к антителу может быть удален либо продолжительным диализом, либо с применением ионообменной хроматографии. Примером такого метода изоляции антител может служить выделение антител к динитрофенильной группе с использованием в качестве гаптена динитрофенола.
Частичная диссоциация комплекса антиген—антитело может быть достигнута в общем случае при повышении температуры. Исходя из того, что антиген — антитело реакция является экзотермической, вполне закономерно, что большинство комплексов антиген — антитело, сформированных при t° 0° может быть хотя бы частично диссоциировано при повышении t° до 40° и выше. Степень термической диссоциации существенно варьирует в зависимости от природы антитела. Особенно эффективно диссоциируют при t° 37— 40° иммунные комплексы, образованные так называемыми Холодовыми антителами, направленными, как правило, к антигенам мембраны эритроцитов.
Наиболее универсальным способом диссоциации иммунных комплексов, образованных самыми разнообразными антителами, служит их обработка разбавленными кислотами и щелочами, а также концентрированными растворами амидов (мочевины, солянокислого гуанидина). Увеличение константы диссоциации комплекса антиген — антитело в этих условиях связано, очевидно, с разрывом нековалентных связей и изменением конформации молекулы антитела (антигена), сопровождающихся, в частности, перестройкой активного центра антитела и детерминантной группы антигена. В числе диссоциирующих комплекс антиген — антитело агентов использовались также полианионы (полиметакрилат и полистиролсульфонат) и концентрированные растворы нейтральных солей.
Обратимость конформационных изменений антитела после его извлечения из иммунного комплекса нуждается еще в дальнейшем изучении. При элюции антител кислотой или щелочью (особенно последней) закономерно отмечают снижение их преципитирующей активности, хотя способность связывать антиген остается, по-видимому, без существенных изменений. Незначительно изменяется сродство антител и после их элюции концентрированной (8М) мочевиной. Судя по этим данным, структура активного центра антитела, извлеченного из иммунного комплекса, возвращается в целом к исходной. Необратимые изменения, по крайней мере у части молекул, претерпевают структуры, ответственные за способность антител участвовать во второй фазе антиген — антитело реакция. В свете современных представлений о механизме антиген — антитело реакция и механизме реакции преципитации можно допустить, что у антител, извлеченных из иммунного комплекса щелочью или кислотой, уменьшается свобода вращательных движений Fab-фрагментов молекулы, хотя нельзя исключить и другие повреждения.
Библиография:
Волькенштейн М. В. Физика ферментов, М., 1967, библиогр.;
Гауровиц Ф. Иммунохимия и биосинтез антител, пер. с англ., М., 1969, библиогр.; Кульберг А. Я. Молекулярные основы эффекторных функций иммуноглобулинов, Усп. совр. биол., т. 7 6, №1,с. 110, 1973, библиогр.; Кэбот Э. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., М., 1968, библиогр.; Незлин Р. С. Строение биосинтеза антител, М., 1972; Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. X. Ходжаева, М., 1973; Cathou R. Е. а. Werner Т. G. Hapten stabilization of antibody conformation, Biochemistry, v. 9, p. 3149, 1970; Edelman G. M. a. Gall W. E. The antibody problem, Ann. Rev. Biochem., v. 38, p. 415, 1969, bibliogr.; Green N. M. Electron microscopy of the immunoglobulins, Advanc. Immunol., v. 11, p. 1, 1969, bibliogr.; Marrack J. R. a. Richards C. B. Light-scattering studies of the formation of aggregates on mixtures of antigen and antibody, Immunology, v. 20, p. 1019, 1971, bibliogr.; Оhta Y., Gill T. J. a. Leung G. S. Volume changes accompanying the antibody-antigen reaction, Biochemistry, v. 9, p. 2708, 1970; Schechter B., Conway-Jacobs A. a. S e 1 a M. Conformational changes in a synthetic antigen induced by specific antibodies, Europ. J. Biochem., v. 20, p. 321, 1971.
А. Я. Кульберг.