РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Полинуклеотидные цепи РНК обладают гибкой структурой, их длина в зависимости от вида РНК может варьировать в очень широких пределах — от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч нуклеотидных остатков. Мол. вес (масса) РНК в среднем 10⁴—10⁶. Последовательность нуклеотидных звеньев, соединенных фосфодиэфирной связью в непрерывную и неразветвлен-ную полинуклеотидную цепь, называют первичной структурой РНК; она строго специфична и уникальна для каждого вида природной РНК. Первичная структура РНК представляет собой форму записи биол. информации, многократно и точно воспроизводящуюся в процессах биосинтеза РНК (см. Трансляция).

Вторичная и третичная структура РНК, определяемая как пространственная конфигурация полинукле-отидной цепи, формируется в основном за счет водородных связей и меж-плоскостных гидрофобных взаимодействий между азотистыми основаниями. Если для молекулы нативной ДНК характерно устойчивое спиральное строение, то макромолеку-лярная структура РНК гораздо более вариабельна и лабильна. В р-рах с низкой ионной силой молекулы РНК ведут себя как типичные сильно разбухшие цепи полиэлектролита, но при повышении ионной силы эти цепи сжимаются, их характеристическая вязкость уменьшается, а скорость седиментации увеличивается. Это объясняется образованием на отдельных участках гибкой цепи РНК, к-рая, перегибаясь, навивается сама на себя, и двуспиральных структур в результате так наз. комплементарного спаривания, аналогичного комплемен-тарности в двуспиральных молекулах ДНК. Стабилизация таких структур в РНК достигается за счет образования водородных связей между противолежащими азотистыми основаниями антипараллельных участков цепи; специфическими парами азотистых оснований между комплементарными участками цепи являются классические А—У, Г—Ц и, реже, Г—У.

Наличие в азотистых основаниях сопряженных двойных связей обусловливает интенсивное поглощение РНК в УФ-области спектра с максимумом при длине волны ок. 260 нм. Образование спиральной структуры сопровождается ослаблением поглощения при 260 нм (так наз. гипо-хромный эффект). Обратный процесс — разрушение двуспиральной структуры, происходящее при понижении ионной силы р-ра РНК или при его нагревании,— называют молекулярным плавлением. Оно объясняется конформационным переходом спираль —> беспорядочный клубок и связано с ослаблением стабилизирующих взаимодействий в молекуле РНК. В этом случае наблюдается гиперхромный эффект — увеличение поглощения при 260 нм.

Молекулы РНК, состоящие из двух комплементарных полинуклео-тидных цепей, обнаружены в нек-рых вирусах растений и животных. Кроме того, двуцепочечные молекулы РНК образуются как промежуточные продукты биосинтеза многих вирусных РНК в клетке; их называют репликативными формами РНК. По многим параметрам (по величине шага спирали, числу пар азотистых оснований на виток — 11—12 пар, углам их наклона к оси спирали, а также по конфигурации сахарофосфатного остова) двуспиральные молекулы или участки молекул РНК похожи на двуспиральные молекулы ДНК в A-форме. Нек-рые двутяжевые РНК подобно ДНК могут существовать в форме кольцевых молекул и в случае, если обе полинуклеотидные цепи ковалентно замкнуты, образовывать супер-спирализованные кольца. РНК способна к формированию двутяжевых комплексов, в к-рых один из тяжей представлен полирибонукле-отидной, а другой — полидезоксирибонуклеотидной цепью. Образование таких ДНК—РНК-гибридов происходит во время репликации ДНК с участием затравочных фрагментов РНК (см. Ревертаза).

Подавляющее большинство природных РНК относится к однотяжевым полинуклеотидам. Однако в полинуклеотидных цепях РНК имеются участки различной длины, состоящие из комплементарных друг другу нуклеотидных последовательностей, включающих от десятков до тысяч нуклеотидных остатков и расположенных на небольшом удалении друг от друга. Благодаря этому в молекулах РНК возникают как короткие, так и весьма протяженные двутяжевые (биспиральные) участки, принадлежащие одной цепи, так наз. шпильки. Модель вторичной структуры РНК со шпилькообразными элементами была создана в конце 50-х —начале 60-х гг. 20 в. в лабораториях А. С. Спирина и Доти (P. Doty).

Первые подходы к определению нуклеотидной последовательности РНК были разработаны в середине 60-х гг. 20 в. в лабораториях Р. Холли, Цахау (H. Zachau) и А. А. Баева; это положило начало анализу структурно-функциональной организации индивидуальных РНК.

Содержание РНК в живых клетках (за исключением сперматозоидов) значительно выше, чем содержание ДНК, и распределение их внутри клетки сложнее. Основная масса РНК локализована в цитоплазме, они входят в состав собственно цитоплазматических Ген), однако имеются косвенные и прямые указания на существование специальных форм хроматиновой РНК, играющей регуляторную роль.

Большинство РНК животных клеток, бактерий и ДНК-содержащих вирусов синтезируется на матрице двуцепочечной ДНК в процессе транскрипции. Одноцепочечные РНК ряда вирусов образуются на матрице дву цепочечных РНК.

Матричный синтез одноцепочечных РНК существенно отличается от репликации ДНК и двуцепочечных РНК: он является консервативным, а не полуконсервативным, т. е. продукт синтеза не включает в себя каких-либо компонентов матрицы (см. Репликация). Консервативный характер синтеза и необходимость реплицировать не обе цепочки матрицы, а лишь одну, и не на всем протяжении матрицы, а только на определенных участках обусловливают существование специальных механизмов узнавания инициаторных и терминаторных последовательностей, определяющих начало и конец синтеза молекулы РНК.

В клетке биосинтез РНК на матрице ДНК осуществляют ферменты РНК-полимеразы (см. Полимеразы). В клетках эукариотов обнаружено по крайней мере три фермента, ответственных за синтез разных типов РНК. В отличие от изученных ДНК-полимераз РНК-полимеразы проявляют определенную специфичность по отношению к разным матрицам и даже участкам матриц. РНК-полимераза катализирует образование 3',5'-фосфодиэфирных связей между мономерными рибонуклеози-дами, используя в качестве субстратов нуклеозидтрифосфаты. Синтез начинается с образования связи между двумя мононуклеотидами, при этом первый из них, как правило, является пуриновым нуклеотидом. Растущая полинуклеотидная цепь РНК удлиняется в направлении 5'->3'. Синтезированная РНК комплементарна матрице ДНК, и порядок включения нуклеотидов в цепь РНК определяется последовательностью нуклеотидов в матрице ДНК, поскольку в основе матричного синтеза лежат закономерности образования комплементарных цепей. Как правило, РНК синтезируются в виде молекул-предшественников (пре-РНК), имеющих больший молекулярный вес, чем функционально активные молекулы. Эти молекулы-предшественники проходят многостадийный процесс созревания — так наз. посттранскрипционный процессинг, к-рый сводится к вырезанию специализированными клеточными ферментами нек-рых последовательностей и модификации первичной структуры в результате ферментативного метилирования, дегидрирования и т. д. азотистых оснований, а также изомеризации нуклеотидов.

Функции РНК в клетке сложны и многообразны. В соответствии с функциональным назначением и структурными особенностями в любой клетке различают три основных типа РНК: рибосомные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК) и информационные, или матричные, РНК (иРНК). Кроме указанных типов РНК, в клеточных ядрах и в цитоплазме в небольших количествах встречаются и другие разновидности молекул РНК. Установлено, что в нек-рых случаях они являются предшественниками РНК вышеперечисленных типов. В цитоплазме и в ядре имеется набор так наз. малых РНК, функции их пока неизвестны.

Рибосомная РНК имеет большой молекулярный вес и характеризуется метаболической стабильностью. Она составляет ок. 80% от всех клеточных РНК. Выделяют ее из очищенных рибосом или их субчастиц путем обработки водным р-ром фенола, к-рый денатурирует белки и делает их нерастворимыми. По весу рРНК составляет от 50 до 65% всего материала рибосом. Рибосомы всех организмов состоят из двух субъединиц: малой и большой. В состав большой субъединицы рибосомы клеток эукариотов входит РНК с мол. весом ок. 1,65•10⁶ (26—28S-PHK), в состав малой субъединицы — РНК с мол. весом ок. 0,65•10⁶ (18S-PHK). Большая и малая субъединицы рибосом клеток прокариотов содержат РНК с мол. весом соответственно ок. 1,1•10⁶ (23S-PHK) и ок. 0,5•10⁶ (16S-PHK).

В каждой субъединице молекула рРНК служит как бы каркасом, на к-ром собираются рибосомные белки; сформировавшийся рибонуклео-протеидный комплекс — так наз. рибонуклеопротеидный тяж (РНП-тяж) — организуется в сложную компактную частицу — собственно рибосомную субъединицу. Концепция РНП-тяжа как основы структурной организации рибосомы разработана в 60-х гг. 20 в. А. С. Спириным.

С рибосомами ассоциирована также РНК с относительно низким мол. весом: 5S-PHK, содержащая ок. 120 нуклеотидов и связанная с большой рибосомной субъединицей; такая РНК обнаружена в бактериальных и животных клетках. Кроме того, в рибосомах эукариотов, как правило, присутствует еще одна низкомолекулярная РНК, так наз. 5,8S-РНК, к-рая довольно прочно ассоциирована с помощью водородных связей с 28S-PHK большой рибосомной субъединицы. Эти РНК являются структурными компонентами рибосомы.

Роль рРНК в белоксинтезирующей системе клетки не исчерпывается их структурными функциями. У прокариотов на 3'-конце молекулы 16S-PHK имеется богатая пиримиди-нами последовательность, комплементарная небольшому участку иРНК, расположенному на 5'-конце ее молекулы. Комплементарное спаривание этих участков, по-видимому, способствует первоначальному связыванию иРНК с рибосомой. Не исключено, что нек-рые участки рРНК играют определенную роль в формировании пептидил-трансферазного центра рибосомы, ответственного за образование пептидных связей при синтезе белка.

Биосинтез рРНК в клетках эукариотов происходит в ядре и осуществляется при участии фермента РНК-полимеразы I. Геном эукариотов содержит много копий генов, кодирующих рРНК; рибосомные гены сгруппированы в виде тандемных повторов и локализованы в одной или нескольких Рибонуклеазы (см.), отделяющие от предшественников рРНК те участки их нуклеотидных цепей, к-рых уже нет в рибосоме, изучены еще мало.

Транспортная РНК составляет примерно 15% от общего количества клеточных РНК. Это относительно низкомолекулярные РНК: их нуклеотидные цепи содержат всего 75—90 нуклеотидов, а мол. вес находится в пределах 23 000—30 000. Ввиду небольшого размера тРНК легко отделяются от молекул других РНК, как правило, гораздо более крупных. Этот тип РНК — наиболее изученный в молекулярном плане элемент белоксинтезирующей системы. Для большинства тРНК определена полная последовательность нуклеотидов в молекуле.

Способ выделения тРНК состоит в обработке одноклеточных организмов или гомогенизированных тканей водным р-ром фенола, осаждении спиртом с последующим отделением рРНК, примесей ДНК и полисахаридов. В результате получают препарат суммарной тРНК. Фракционирование препаратов суммарной тРНК осуществляют с помощью ряда физических, химических или комбинированных методов.

Особенностью тРНК, отличающей ее от других РНК, является относительно высокое содержание минорных нуклеотидов. На основании данных о первичной структуре тРНК была предложена и экспериментально подтверждена модель вторичной структуры, плоское изображение к-рой напоминает клеверный лист. Сравнение структур различных тРНК, организованных в «клеверный лист», выявляет ряд общих черт. Во всех этих структурах имеется 4 двуцепочечных спиральных участка, 3 из к-рых являются «шпильками», несущими петли из неспаренных нуклеотидов; 3'- и 5'- концы полинуклеотидной цепи объединены в наиболее длинный спирализован-ный участок, содержащий 7 пар азотистых оснований, завершающийся неспаренным акцепторным тринук-леотидом ЦЦА, к к-рому присоединяется аминокислота. Противолежащая акцепторному концу петля содержит тринуклеотид антикодон, к-рый обеспечивает специфичность взаимодействия с комплементарным ему триплетом-кодоном в иРНК. Нуклеотиды, образующие антикодон, всегда расположены в середине петли. Боковые петли, видимо, играют важную роль в связывании тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазой и с комплексом рибосома — и PH К.

Дальнейшее исследование структуры тРНК показало, что нативные молекулы имеют компактную форму: отдельные двуспиральные «шпильки» «клеверного листа» складываются в специфичную третичную структуру, к-рая является близкой у всех тРНК. Способность тРНК образовывать кристаллы позволила применить для изучения пространственной структуры ее молекулы метод рентгеноструктурного анализа. В 1973 —1975 гг. третичная структура одной из тРНК была расшифрована в лабораториях Рича (A. Rich) и Клуга (A. Klug). Согласно модели Рича — Клуга макромолекула тРНК имеет L-образную форму, причем основные функциональные центры молекулы — антикодоновая петля и акцепторный конец — находятся на ее концах. Расстояние между ними составляет 7,6 нм. За стабилизацию третичной структуры ответственны взаимодействия азотистых оснований, отличные от тех, к-рые обусловливают комплементарное спаривание по Уотсону—Крику.

Структура тРНК отличается большой консервативностью, что, по-видимому, связано с высокой степенью ее функциональной специализации. Этот класс молекул в ходе биосинтеза белков (см.) выполняет по отношению к аминокислотам функцию адапторов, к-рые с помощью высокоспецифичных ферментов — аминоацил-тРНК-синтетаз — присоединяют к себе ту или иную аминокислоту и переносят ее на рибосому. Связывание аминокислоты с тРНК происходит за счет образования ковалентной связи между СООН-группой аминокислоты и остатком рибозы З'-концевого аденозина тРНК. Фермент, осуществляющий этот процесс, — аминоацил-тРНК-синтетаза — способен «узнавать» как аминокислоту, так и соответствующую ей тРНК.

Существует целый набор различных тРНК, в к-ром каждая тРНК специфична по отношению к какой-либо одной аминокислоте. В клетке имеется примерно 20 различных аминокислот, однако установлено, что в ряде случаев для одной и той же аминокислоты имеется две или более — иногда пять или шесть — видов тРНК. Такие тРНК называют изоакцепторными тРНК.

В ходе синтеза полипептида на рибосоме тРНК «узнает» специфическую аминоацил-тРНК-синтетазу, от к-рой она принимает соответствующую активированную аминокислоту; затем присоединяется к кодону иРНК на рибосоме и тем самым обеспечивает строгую специфичность выбора и встраивания аминокислоты в аминокислотную последовательность растущего полипептида; после образования пептидной связи тРНК удерживает на рибосоме растущую полипептидную цепь.

В геноме E. coli насчитывается несколько десятков генов, контролирующих синтез тРНК. В клетках эукариотов их число много больше; по всей видимости, структурные гены тРНК распределены по разным хромосомам. Нуклеотидная цепь тРНК синтезируется в ядре при помощи фермента РНК-полимеразы III и появляется в цитоплазме в виде макромолекулярного предшественника, к-рый не содержит метилированных оснований. Предшественник длиннее функционально активной тРНК и имеет несколько менее компактную третичную структуру. Кроме того, в ряде случаев РНК-полимераза строит нуклеотидную цепь без трех последних нуклеотидов: 3'-конец каждой молекулы тРНК, заканчивающийся триплетом ЦЦА, образуется позже при участии особого фермента.

Как и рРНК, тРНК проходит стадию созревания, по завершении к-рой молекулы тРНК приобретают окончательную конформацию. Процесс превращения предшественника в тРНК сводится к вырезанию специальными клеточными ферментами дополнительных последовательностей и к модификации первичной структуры. Одним из многочисленных типов модификации является метилирование нуклеотидов с помощью тРНК-метилаз.

Информационная, или матричная, РНК составляет весьма незначительную часть общей массы клеточной РНК, всего 5—10% . В отличие от рРНК итРНК фракция иРНК характеризуется выраженной гетерогенностью по размеру молекул (мол. вес иРНК доходит до 2-106), т. к. она представляет собой совокупность молекул, программирующих синтез всех клеточных белков. В связи с этим относительное содержание индивидуальной иРНК в суммарном препарате РНК может составлять тысячные доли процента.

В то время как рРНК и тРНК метаболически устойчивы, иРНК в ряде случаев, особенно у прокариотических организмов, является относительно короткоживущей. Ее нуклеотидный состав близок к составу ДНК, выделенной из того же организма. В составе большинства иРНК обнаружены последовательности полиА, ковалентно связанные с З'-концом молекулы. Полиаденило-вый «хвост» иРНК содержит от нескольких десятков до сотен нуклеотидов и является характерной особенностью этого типа РНК.

Значительная часть цитоплазматической и PH К животной клетки локализуется в составе полисом (по-лирибосом), компонентами к-рых является транслируемая иРНК и связанная с ней группа рибосом, находящихся на разных стадиях трансляции и содержащих растущие по-липептидные цепи разной длины. Полисомы или их субфракции, полученные тем или иным способом, служат основным источником иРНК, выделение к-рой можно проводить путем непосредственной депроте-инизации полирибосом или после предварительного выделения полисомного иРНП (рибонуклеопро-теида). Наличие полиА в и РНК позволяет применять рациональные способы ее выделения из гетерогенных препаратов РНК, основанные на использовании специфических свойств полиА. В нек-рых случаях полиаденилированную иРНК выделяют непосредственно из нефракци-онированного цитоплазматического экстракта. Эти методы основаны на образовании водородных связей между полиА в и РНК и комплементарными олиго- или полинуклеотидами, иммобилизованными на инертных носителях. В качестве таких аффинных носителей (сорбентов) применяют полиУ-сефарозу и олиго (дезокситимидин)-целлюлозу. Иногда для выделения иРНК используют избирательную сорбцию полиА-содержащих иРНК на нитроцеллюлоз-ных фильтрах или колонках с химически модифицированными целлюлозами, обусловленную аномальными сорбционными свойствами аденилового гомополирибонуклеотида.

Из структурных признаков, характеризующих почти любую иРНК животного происхождения, следует отметить наличие блокированного метилированного 5'-конца, так наз. кэпа, содержащего 7-метилгуанозин, связанный с Б'-концевым нуклеотидом 5'—5'-трифосфатным мостиком. Кэп необходим для эффективной инициации синтеза белка на иРНК и, вероятно, для защиты Б'-конца молекулы иРНК от клеточных экзо-нуклеаз (см. Нуклеазы). Между кэпом и инициаторным кодоном АУГ, определяющим начало синтеза белковой цепи, существует 5'-конце-вая зона, не транслируемая в последовательность аминокислот. Далее следует транслируемая, т. е. кодирующая белок, область, длина к-рой варьирует в широких пределах в зависимости от молекулярных размеров кодируемого полипептида. В клетках прокариотических организмов транслируемая область иРНК обычно содержит информацию для синтеза нескольких полипептидных цепей, т. е. относится к так наз. поли-цистронному типу. Сегменты поли-цистронной иРНК, соответствующие каждому гену, транслируются раздельно благодаря наличию между ними внутримолекулярных сигналов инициации и терминации трансляции. иРНК животных клеток являются, как правило, моноцистронны-ми. Это справедливо и для таких иРНК, к-рые кодируют образование нескольких полипептидных цепей; образование зрелых полипептидов, закодированных в такой матрице, обеспечивается посттрансляционным протеолитическим расщеплением первичного продукта синтеза.

В З'-концевой зоне молекулы иРНК между терминаторным кодоном, ограничивающим транслируемую область, и полиА локализована нуклеотидная последовательность значительной длины, не несущая информации о структуре кодируемого белка. Функция ее пока не ясна.

В изучении первичной структуры иРНК достигнуты заметные успехи. Полностью установлена первичная структура иРНК а- и Р-цепей гемоглобина кролика и человека (см. Талассемия) может быть связано с мутацией в 5'-концевой области, нарушающей связывание иРНК с рибосомами или вызывающей преждевременную терминацию белкового синтеза.

Аналогичные данные были получены и в случае болезни Вильсона— Коновалова (см. Дыхательные пигменты) — основного медьсодержащего гликопротеида плазмы крови. Количественная недостаточность этого белка объясняется, вероятно, дефектом структурной организации Б'-конца церуло-плазминовой иРНК, к-рая определяет как связывание иРНК с рибосомой, так и синтез сигнальной пептидной последовательности.

Нек-рые формы наследственной патологии щитовидной железы человека, как полагают, обусловлены аномалией в структуре пре-иРНК, приводящей к нарушениям ее пост-транскрипционного процессинга и переноса в цитоплазму.

Различные иРНК имеют выраженную вторичную структуру; в состав двуцепочечных участков вовлечено до 75% всех нуклеотидных последовательностей иРНК. Значительная часть участков вторичной структуры в иРНК идентифицирована как «шпилечные» структуры. Внутримолекулярные участки вторичной структуры локализованы, по-видимому, как в транслируемой зоне иРНК, так и в З'-концевой и 5'-кон-цевой нетранслируемых частях ее молекулы. Роль участков вторичной структуры и реализации матричных функций иРНК пока не установлена. Возможно, они обеспечивают адекватное пространственное взаимодействие кэпа и инициирующего кодона, необходимое для их одновременного участия в связывании иРНК на рибосоме. Предполагают также, что «шпильки» играют роль специфических структур, обусловливающих узнавание определенных участков иРНК белковыми компонентами ядерных и цитоплазматических иРНП, так наз. информосом.

В ядре и в цитоплазме животных клеток иРНК в свободном состоянии не переносится, а всегда находится в комплексе со специализированными белками. Белковые компоненты различаются в ядерных и цитоплазматических РНП-частицах: часть ядерных белков-носителей оставляет иРНК в момент ее перехода в цитоплазму и заменяется на транспортирующие белки другого типа — образуются цитоплазматические инфор-мосомы. Функции информосомных белков не ограничиваются внутриклеточным транспортом иРНК и защитой ее от повреждений; предполагают, что они способствуют отделению новообразованной иРНК от ДНК матрицы, ее посттранскрипционному созреванию в ядре, а также играют регуляторную роль в процессах созревания и депонирования нек-рых и PH К в цитоплазме.

Цитоплазматические и ядерные иРНП-частицы были открыты и широко исследованы в нашей стране в начале 70-х гг. 20 в. в лабораториях А. С. Спирина и Г. П. Георгиева.

Как и все перечисленные типы клеточных РНК, иРНК представляют собой популяцию молекул, «скопированных» с соответствующих участков генетической нуклеиновой к-ты (чаще всего ДНК). Однако, если рРНК и тРНК относятся к обслуживающему аппарату белоксинтези-рующей системы клетки, то иРНК является прямым посредником между ДНК и белками и является матрицей для синтеза последних. Т. о. в форму иРНК переводится большая часть информации, содержащейся в ДНК.

В бактериальных клетках еще до завершения синтеза молекулы иРНК может начинаться ее трансляция: рибосомы связываются с отделившимся готовым участком иРНК и образуют полисому, синтезирующую белок. В животных клетках места синтеза белка и РНК пространственно разобщены: иРНК синтезируется в клеточном ядре в виде гигантского предшественника (пре-иРНК). Помимо последовательности иРНК, в молекулах пре-иРНК имеется большое количество участков, выполняющих регуляторные и различные вспомогательные функции. Молекулы пре-иРНК не имеют кэпа и полиаденилового «хвоста» — последний наращивается сразу после завершения транскрипции при помощи так наз. безматричного синтеза, катализируемого концевой поли-А-синтетазой. Из ядра пре-иРНК в составе РНП-частиц — информосом — транспортируется в цитоплазму. В процессе выхода пре-иРНК в цитоплазму основная часть вспомогательных нуклеотидных последовательностей в ней разрушается — молекула претерпевает ряд весьма существенных структурных превращений, включающих образование кэпа, специфическое фрагментирование, метилирование, изомеризацию и т. д., т. е. посттранскрипционный процессинг.

Характерной особенностью многих пре-иРНК эукариотов является наличие внутри информационной зоны молекулы некодирующих участков — интронов, размеры к-рых могут быть весьма значительными; количество таких вставок, не несущих информации для синтеза белка, в разных генах различно. Сложная внутренняя топография молекул пре-иРНК обусловливает сложную картину последовательных реакций посттранскрипционного созревания и формирования зрелой иРНК, кодирующая зона к-рой непрерывна и не содержит интронов. Высокоспецифичные процессы вырезания некодирующих вставок из молекулы пре-иРНК и их объединения (сшивки) получили название сплайсинг. Ферментная система сплайсинга, а также его биол. роль остаются пока совершенно неисследованными.

Гистохимические методы определения рибонуклеиновых кислот в тканях. В основе гистохим. методов выявления РНК в тканях и клетках лежат реакции на компоненты, образующиеся в результате гидролиза этих к-т. Для выявления РНК в ядре и цитоплазме обычно применяют метод Браше, сущность к-рого состоит в специфической деполимеризации РНК рибонуклеазой, ДНК при этом не затрагивается. Параллельно используются два среза ткани, из к-рых один предварительно подвергается действию рибонуклеазы. Затем оба среза окрашивают метиловым зеленым — пиронином, к-рый обладает избирательным сродством к РНК. Считают, что материал, окрашивающийся пиронином в красный цвет и исчезающий после обработки рибонуклеазой, представляет собой РНК. Срезы можно окрашивать также 1% водным р-ром толуидинового синего или 1% р-ром толуидинового синего в 95% этиловом спирте; РНК при этом окрашиваются в синий цвет. Для выявления не только РНК, но и их связи со структурами клетки после окрашивания толуидиновым синим срезы докрашивают 2% р-ром оранжевого G в 5% фосфорновольфрамовой к-те.

Кроме метода Браше, для выявления РНК пользуются красителем, носящим название галлоционин-хромовые квасцы, к-рый дает устойчивую окраску, не меняющуюся при обезвоживании в спирте и просветлении в ксилоле. Окрашивание можно проводить при любых значения pH в пределах от 0,8 до 4,3, но при низких значениях pH (1,5—1,75) специфическое окрашивание РНК максимально. Нек-рые исследователи считают метод выявления РНК с помощью красителя галлоционин-хромовые квасцы более надежным, чем метод Браше. Его используют и для количественного гистохим. определения нуклеиновых к-т.

Для изучения синтеза и обмена РНК применяют и гистоавторадиографию часто в сочетании с электронной авторадиографией (см.). В качестве радиоактивной метки используют 3H-урацил.

При гистохим. изучении локализации РНК в индивидуальных клетках или на тканевых срезах пуриновые и пиримидиновые основания выявляют по интенсивности поглощения в УФ-свете. Нуклеиновые к-ты благодаря наличию гетероциклических пуриновых и пиримидиновых оснований интенсивно поглощают УФ-свет с длиной волны 260 нм. При фотографировании клеток в этих лучах структуры, содержащие нуклеиновые к-ты, идентифицируются довольно легко. Однако с помощью этого метода нельзя проводить прямое дифференциальное определение ДНК и РНК.

Локализацию РНК в клетках и срезах можно определять по углеводному компоненту. После мягкого гидролиза соляной к-той, вызывающей отщепление пуриновых оснований и высвобождение реакционно-способных альдегидных групп остатка сахара, проводят реакцию с метилтриоксифлуореноном. При этом углеводный компонент РНК — рибоза — реагируя с красителем, образует соединение, окрашенное в желто-розовый цвет.

Гистохимически РНК идентифицируют также по выявлению фосфорной к-ты. Фосфатные группы нуклеиновых к-т можно избирательно определять с помощью окрашивания основными красителями. Напр., использование акролеина и толуидинового синего при наличии РНК приводит к появлению нежно-красного окрашивания (ДНК в этих условиях дает темно-синий цвет). Кре-зиловый фиолетовый реагируете РНК в стехиометрических количествах при pH 4,2 и поэтому может быть использован для цитофотометрического количественного определения РНК с применением УФ-микроспектрофотометрии (см. Цитофотометрия).

Библиография: Гайцхоки В. С. Информационные РНК клеток животных, М., 1980, библиогр.; Дэвидсон Д ж. Н. Биохимия нуклеиновых кислот, пер. с англ., М., 1976; Органическая химия нуклеиновых кислот, под ред. Н. К. Кочеткова и Э. И. Будовского, М., 1970; Спирин А. С. и Гаврилова JI. П. Рибосома, М., 1971; Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология гена, пер. с англ., М., 1978; Шабарова 3. А. и Богданов А. А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов, М., 1978; Akzesso-rische Methoden in der Histochemie, hrsg. v. G. Geyer u. H. Luppa, Jena, 1975; Bra-ch et J. Embryologie chimique, P., 1944; Culling Ch. F. A. Handbook of his-topathological and histochemical techniques, L., 1974; Pearse A. G. Histochemistry, v. 1—2, L., 1968 —1972.

П. Л. Иванов; В. В. Серов (гист.).