РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Радиоиммунологический метод (РИА; син. радиоиммунологический анализ) — основанный на реакции антиген—антитело метод количественного определения биологически активных соединений, обладающих антигенными свойствами, и антигенов микроорганизмов с помощью аналогичных известных антигенов или антител, меченных радиоактивным изотопом. Радиоиммунологический метод позволяет количественно определять в жидкостях организма (сыворотка крови, моча и др.) содержание гормонов и различных антигенов, в т. ч. антигенов микроорганизмов. Основным достоинством Радиоиммунологического метода является его очень высокая чувствительность благодаря использованию изотопной метки антигенов (или антител) и применения сывороток с высоким сродством и специфичностью антител (см.).

Становление и развитие Радиоиммунологического метода связано с работой Ялоу и Берсона (R. S. Yalow, S. A. Berson, I960), предложивших этот метод для определения эндогенного инсулина в плазме крови.

Сущность Р. м. состоит в использовании для определения антигенов (см.) соответствующих иммунных сывороток и введении в систему антиген — антитело антигена, меченного радиоактивным изотопом, напр, йода (¹²⁵I), в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Т. к. меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая часть осталась несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. При определенных концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом:

После взаимодействия антигенов с антителами образовавшиеся комплексы антиген—антитело (см. гель-фильтрации (см.), фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом, сульфатом аммония и др., а также с помощью агрегации иммунных комплексов антиглобулиновой сывороткой или сорбции их на иммобилизованных (прикрепленных к поверхности твердой фазы) антителах. Кроме этого, возможна сорбция свободного меченого антигена с помощью добавленных веществ, напр, талька, целлюлозы, кварца, активированного угля и др. Отделив меченый несвязанный антиген от комплекса антиген— антитело, определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе но количеству импульсов (с помощью сцинтилляционного счетчика). Снижение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с анти-сывороткой, в результате чего меченый антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген— антитело.

Иммунную сыворотку против определяемого антигена и меченого антигена предварительно оттитровывают и используют в Р. м. в оптимальном разведении, при к-ром происходит связывание 50% внесенной метки. Для оценки результатов применяют данные (график) зависимости связывания меченого антигена сывороткой в оптимальном разведении от концентрации меченого (стандартного) антигена.

Широко применяются в Р. м. антитела сыворотки против антигена, иммобилизованные (адсорби рованные) на поверхности пластика или химически связанные с поверхностью полимера. В 1966 г. Кетт (K. J. Catt) с группой исследователей, а также Уайд и Порат (L. Wide, J. P. Porath) применили в Р. м. иммобилизацию антител на полимере. Была показана возможность иммобилизации антител на сефадексе и целлюлозе, обработанных бромцианом, а также на различных пластмассах без предварительной обработки активатором. Для проведения реакции в полистироловые пробирки с иммобилизованными на внутренней поверхности антителами вносят определяемый антиген. После инкубации несвязанный антиген удаляют промыванием и вносят меченый антиген, который затем удаляют таким же образом, определяя в дальнейшем долю связанной радиоактивной метки.

Существует разновидность Р. м.— метод двойной системы антител, когда комплекс антиген—антитело обрабатывается антиглобулиновой преципитирующей сывороткой (вторые антитела) с последующим отделением преципитата центрифугированием. Добавление вместе с антиглобулиновой сывороткой нормальной сыворотки крови того же животного. от к-рого получены первые антитела, способствует преципитации комплексов.

Определение антигена с помощью меченых антител получило название иммунорадиометрического метода. В этом случае антиген предварительно фиксируют на твердой фазе, напр, в полистироловых пробирках. При постановке реакции определяемый антиген образует комплекс с мечеными антителами, который остается в растворе, а не прореагировавшие антитела взаимодействуют с антигеном, прикрепленным к твердой фазе. В варианте иммунорадиометрического метода — методе двойного связывания — определяемый антиген образует комплекс с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Затем после удаления свободного антигена промыванием поверхности твердой фазы добавляются меченые антитела, выявляющие комплекс. Радиоактивность комплекса антитело — антиген — антитело — ¹²⁵I сравнивается с радиоактивностью контрольных проб, проб, заведомо содержащих и не содержащих антиген.

Высокая чувствительность Радиоиммунологического метода (до пикограмм определяемого вещества) позволила более точно определить концентрацию многих биологически активных соединений. К недостаткам Р. м. относят возможное снижение специфичности за счет посторонних примесей в определяемом образце, напр, некоторых лекарств, и наличие в сыворотке крови перекрестно реагирующих антител. Кроме того, у антигенов и антител, меченных гамма-излучающими изотопами, короткий срок хранения; при работе с ними следует соблюдать особые меры безопасности. В этом отношении существует менее опасный метод, сходный по принципу с Р. м., в к-ром применяются антигены или антитела, меченные ферментом (см. Энзим-иммунологический метод). Широкое внедрение Р. м. затруднено из-за трудности получения стандартных меченых сывороток и антигенов, необходимости соблюдать правила работы с радиоактивными веществами, применять дорогостоящее оборудование (гамма- и бета-счетчики, камеры глубокого охлаждения, компьютеры и др.) и реактивы с высоким требованием к чистоте стандартов, а также высокоспецифические сыворотки.

См. также Радиоизотопное исследование.

Библиография: Иммунологические методы исследования в клинике и эксперименте, под ред. А. Я. Лысенко, М., 1978; Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979; Чард Т. Радиоиммунологические методы, пер. с англ., М., 1981, библиогр.; Yаlоw R. S. a. Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, J. clin. Invest., v. 39, p. 1157, 1960.

А. С. Быков.