ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологические методы исследования (греч. histos столб, ткань + logos учение) — методы, применяемые для изучения строения и функций клеток и тканей растительных и животных организмов в норме, патологии и в эксперименте. Более узким по сравнению с Гистологическими методами исследования является термин «гистологическая техника», к-рым обозначают комплекс методических приемов, используемых в гистологии (см.), а также в нормальной и патологической анатомии, гл. обр. при изготовлении препаратов клеток и тканей для их последующего микроскопирования.

История

История развития Гистологических методов исследования тесно связана с совершенствованием микроскопической техники. В 17 —18 вв. под микроскопом изучали высушенные, позднее — живые объекты. С увеличением разрешающей способности микроскопов появилась возможность изучения мелких деталей клеток и тканей. Это потребовало изготовления более тонких, пропускающих достаточное количество света препаратов, для чего использовали различные приемы раздавливания, мацерации, расщепления тканей. Затем стали изготовлять срезы тканей, сначала от руки бритвой и лишь с 70-х гг. 18 в. с помощью специальных приспособлений — микротомов. Только в 19 в. были разработаны основные приемы изготовления постоянных гистологических препаратов (пригодных для многократного использования в течение длительного времени): фиксация, пропитывание тканей в средах, позволяющих изготавливать тонкие срезы на микротоме, окраска и заключение срезов в различные среды.

В первой половине 19 в. чешский физиолог и гистолог Я. Пуркинье применил с помощью специальных методов заливки уплотнение исследуемых тканей, ввел в гистологическую технику бальзам, просветление тканей в скипидаре и оливковом масле, окраску препаратов индиго и др. В 1842 г. Ганновер (A. Hannover) предложил в качестве фиксатора хромовую к-ту, в 1844 г. Майер (С. Mayer) сделал попытки микрофотографирования. В 1851 г. был применен кармин для окраски, в 1860 г. — серебрение тканей (Ф. Реклингхаузен). С появлением первых теоретических работ о механизмах фиксации и окраски [Витт (О. Witt), 1890; П. Эрлих, 1891] гистологических объектов техника гистол, исследований стала быстро развиваться.

В развитии гистологической техники важная роль принадлежит отечественным исследователям. В 1782 г. А. М. Шумлянский применил очень тонкие методы инъекции красящих р-ров для изучения кровеносных сосудов и мочевых канальцев почек.

А. И. Бабухин внес ряд усовершенствований в конструкцию микроскопа и микротома. К. А. Арнштейн, А. С. Догель, О. Е. Смирнов усовершенствовали метод окраски нервных элементов метиленовым синим (см. Догеля метод).

Пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния

Существуют два основных пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния:

1) исследование живых (переживающих) клеток и тканей;

2) исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих в той или иной мере морфологические особенности и химическую структуру, присущую данному виду тканей. Во втором случае исследование начинается с выбора способа фиксации, затем следует заливка препаратов и приготовление срезов, окрашивание и заключение препаратов в среды.

Исследование живых или переживающих объектов (витальное и суправитальное) дает возможность наблюдать физиол, процессы в клетках и тканях, исследовать прижизненное их строение. Витальным наблюдением принято называть исследование клеток и тканей в живом организме, суправитальным — исследование живых клеток и тканей, выделенных из организма непосредственно перед исследованием и помещенных в соответствующие условия наблюдения. Прижизненные наблюдения можно проводить на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде или выделенных из фрагментов тканей (простейшие, клетки крови, эпителиальные клетки соскобов слизистых оболочек и т. п.). Большие возможности для прижизненного наблюдения клеток и тканей дает метод автономному росту (см.), чувствительность к различным факторам и пр. Клетки помещают в капле физиол. р-ра или среды, в к-рой они культивируются, на предметное стекло (обычный размер 76 X 26 мм, толщина 1—2 мм), накрывают покровным стеклом (обычный размер 18 X 22 мм, толщина 0,15—0,20 мм) и изучают под микроскопом. Для предотвращения охлаждения и высыхания препаратов используют специальные приспособления (камеры с подогревом и заданной влажностью, нагревательные столики и т. п.). Простейшим приемом, предотвращающим высыхание препаратов, может служить смазывание краев покровного стекла растопленным парафином, вазелином и т. п.

Для изучения процессов образования антител, продукции гормонов, кроветворения, злокачественного роста и др. нередко применяют культивирование ' клеток в диффузионных камерах, стенки которых сделаны из миллипорных фильтров, пропускающих макромолекулы, но не пропускающих клетки. Такие камеры имплантируют в различные ткани организма, наблюдая изменения находящихся внутри камеры клеток под влиянием гуморальных факторов организма или веществ, введенных в камеру одновременно с клетками.

Объектом прижизненного наблюдения могут служить и тонкие, пропускающие свет тканевые пленки (брыжейка, плавательные перепонки и т. п.). Выделенную брыжейку животных, напр., можно наблюдать под микроскопом, не нарушая ее нервных и сосудистых связей с организмом. Помещая органы во влажные прозрачные камеры, можно наблюдать многие микрофизиологические процессы в ряде органов лабораторных животных. Так, напр., у крысы удалось наблюдать [Блум и Фоситт (W. Bloom, D. Fawcett), 1968] процесс овуляции и перемещения яйца в яйцевод. Методы выведения органов и тканей во влажные прозрачные камеры без нарушения связей с организмом могут использоваться лишь в острых опытах. Для продолжительных, повторяющихся наблюдений используют различные модификации предложенного Сэндисоном (J. С. Sandison, 1924) так наз. метода окошечек. При этом сквозное отверстие, сделанное в ухе кролика (или в складке кожи), с обеих сторон плотно закрывают тонкими стеклянными (или иными прозрачными) пластинками. В пространство между пластинками прорастает окружающая соединительная ткань с сосудами, что можно наблюдать, помещая «окошечко» под микроскоп. С помощью этого метода были сделаны важные наблюдения над развитием и функцией мелких тканевых сосудов и капилляров, поведением трансплантатов различных органов и т. д. Естественной прозрачной средой для прижизненных микроскопических наблюдений за теми или иными тканями может служить передняя камера глаза животных, в к-рую имплантируют изучаемую ткань. Так, в передней камере глаза удалось наблюдать первые стадии развития оплодотворенного яйца мыши, циклические изменения в кусочке трансплантированного эндометрия обезьяны (Блум и Фоситт, 1968), реактивные изменения имплантатов скелетной мышечной ткани и т. д.

Важное место среди приемов исследования живых клеток и тканей занимают методы микрургии (см.), т. е. совокупность методических приемов, дающих возможность производить разнообразные операции над помещенными в питательную среду очень мелкими и микроскопическими объектами (простейшими, клетками или комплексами клеток многоклеточных животных, яйцами иглокожих, земноводных, зародышами, внутриклеточными структурами и т. п.). В зависимости От размеров объекта операции производят вручную или с помощью специальных микроманипуляторов (см. ниже, раздел «Аппараты для гистологических исследований»). С их помощью можно производить пересадки ядер и ядрышек, введение в изолированные клетки различных веществ, подведение к клеточным мембранам микроэлектродов и т. д. Для локального разрушения микроструктур клеток, напр, ядрышек, используют сфокусированный пучок ультрафиолетовых лучей («лучевой микроукол») — прием, впервые предложенный С. С. Чахотиным в 1912 г. Использование методов прижизненных наблюдений ограничивается большими техническими трудностями, связанными со свойствами тканей (непрозрачность, оптическая однородность и т. д.), с повреждающими воздействиями освещения (особенно ультрафиолетовыми лучами и др.), токсическим действием красителей и т. п. Вследствие этого при исследовании живых и переживающих объектов , следует особенно тщательно подбирать специальные методы микроскопического исследования в каждом отдельном случае. Для витального исследования могут быть применены следующие методы микроскопии.

1. Микроскопия в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) основана на явлении рассеивания света на границе двух объектов с разными показателями преломления (напр., ядро и цитоплазма). Темнопольный микроскоп отличается от обычного только специальным конденсором, приспособленным для бокового освещения объекта. Т. о., прямой свет в объектив не попадает, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым на темном фоне. Так, напр., в живой клетке ядрышко, ядерная мембрана, митохондрии, жировые капли и другие включения будут светиться на темном фоне неструктурированной цитоплазмы. Метод находит применение в экспериментальной микробиологии, лабораторной диагностике, в частности для обнаружения бледных трепонем, и др.

2. Фазово-контрастная микроскопия (см.) и интерференционная микроскопия основаны на свойстве биол, структур, прозрачных для видимого света, изменять фазу проходящих через них лучей. Поскольку в разных участках объекта, отличающихся показателем преломления и толщиной, эти изменения неодинаковы, биол, структуры становятся видимыми. Фазово-контрастную и интерференционную микроскопию живых клеток и тканей, особенно физиологических процессов клеток культуры тканей, часто сочетают с замедленной (цейтраферной) или с ускоренной микро-киносъемкой, с помощью к-рой можно не только зафиксировать эти процессы, но и представить их в динамике. Интерференционную микроскопию используют также для получения количественных данных о сухой массе, показателях преломления объектов и их толщине. Разновидностью фазово-контрастного микроскопирования является аноптральная микроскопия.

3. Поляризационная микроскопия основана на свойстве анизотропии (двойного лучепреломления) структур в клетках и тканях и применяется гл. обр. для выявления и идентификации некоторых кристаллических веществ и липидов, а также поперечно-полосатых мышц, коллагена, миелина и т. д.

4. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (см. Иммунофлюоресценция). Большие возможности для прижизненных наблюдений дает метод контактной флюоресцентной микроскопии (E. М. Брумберг, 1964), позволяющий получать изображения с поверхности органов и тканей. При этом используются специальные объективы, выполняющие одновременно роль опак-иллюминатора и конденсора.

5. Ультрафиолетовая микроскопия основана на абсорбции ультрафиолетовых лучей хим. структурами клеток (белки, нуклеиновые к-ты). Этот метод применим для прижизненных наблюдений, однако наибольшее распространение он нашел в количественной цито- и гистохимии — метод абсорбционной цитоспектрофотометрии (см. Цитофотометрия).

Способом улучшения условий микроскопического наблюдения над живыми объектами является прижизненное окрашивание их специальными красителями (см. Витальная окраска), позволяющее изучить детали строения микроскопических объектов и исследовать некоторые их физиологические свойства.

Несмотря на наличие многочисленных методов витальной микроскопии и на их большое значение, наиболее полную картину строения клеток и тканей можно получить при параллельном изучении живых и фиксированных объектов. Исследование фиксированных объектов дает возможность изучать структуру клеток и тканей неживых объектов.

Фиксация — сохранение структуры клеток тканей и микроорганизмов путем быстрого воздействия на них хим. или физ. агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений; привнесение артефактов при этом минимальное. Некоторые методы Муравьиный альдегид) или глютаральдегид, вызывающие минимальную денатурацию белка и сохраняющие многие ферментные системы.

Большинство фиксаторов применяют в виде р-ров, действующих гл. обр. на белковые компоненты клеток и тканей. Входящие в состав фиксирующих смесей вещества (формальдегид, сулема и т. д.) образуют прочные связи между белковыми молекулами. Так, формальдегид реагирует с аминами, карбоксильными и индольными группами белка, в результате чего между белковыми молекулами образуются метиленовые мостики; сулема действует на сульфгидрильных, карбоксильные и аминогруппы белка, образуя ртутные мостики между белковыми молекулами. Соли хрома вызывают окисление и осаждают белки и фосфолипиды. Широкое распространение получили фиксаторы, содержащие пикриновую к-ту. Одним из лучших фиксаторов для исследования цитологических объектов является четырехокись осмия (OsO₄), часто используемая для фиксации объектов, подвергающихся электронной микроскопии (см.).

При выборе фиксирующих смесей необходимо учитывать проницаемость ткани для разного вида фиксаторов. В случае медленного проникновения фиксатора в тканях могут развиться деструктивные изменения, связанные с аутолитическим действием ферментов, аноксией и т. п. Плохо проникает в фиксируемую ткань, напр., четырехокись осмия. Поэтому в р-рах осмия фиксируют кусочки тканей толщиной не более 0,5—1,0 мм. При проведении гистохим. исследований (см. Лиофилизация), а также замещения в замороженном состоянии. Лиофилизации состоит в быстром замораживании ткани (обычно используют жидкий азот) и ее обезвоживании (сушке) в вакууме при t° —30—40°. При методе замещения в замороженном состоянии замороженные при температуре жидкого азота ткани затем выдерживают при t° —20—60° в реактиве, растворяющем кристаллы льда (этиловый и метиловый спирт, ацетон). Оба названных метода позволяют сохранить хим. состав клеток и тканей практически неизмененным.

По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты, имеющиеся в ткани (кость, хитин, отложения извести и др.), размягчают воздействием к-т или с помощью постоянного электрического тока — так наз. электролитическая декальцинация (см.) и после удаления из ткани к-ты приступают к изготовлению постоянных препаратов. Для изучения фиксированных объектов применяют многочисленные методы светооптической и электронной микроскопии.

В гистологической технике использование тотальных препаратов (мазки, отпечатки, пленочные препараты и т. п.) ограничено, и обычно приходится прибегать к изготовлению срезов тканей с помощью микротомов (см. ниже). Наиболее удобным способом, обеспечивающим быстрое изготовление срезов, является замораживание кусочка ткани. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы. Метод замораживания нельзя применять при работе с очень мелкими объектами; срезы некоторых тканей и органов крошатся и при оттаивании распадаются и т. д., в связи с этим ряд объектов приходится заливать в среды.

Заливка препаратов и изготовление срезов

Чаще прибегают к заливке объекта исследования в соответствующую среду, к-рая его пропитывает и уплотняет до консистенции, пригодной для изготовления срезов. Из сред для заливки наибольшее распространение получили парафин и целлоидин. Фиксированную ткань обезвоживают и пропитывают одним из этих веществ, проводя ее через промежуточный растворитель (ксилол или толуол для парафина, спирт-эфир — для целлоидина). Примерная схема заливки в парафин следующая. Кусочек ткани обезвоживают, проводя через ряд р-ров спирта возрастающей крепости (от 40 до 100%), затем помещают в смесь 100% спирта и ксилола (1 : 1), в ксилол (две порции), в смесь ксилола с парафином (1:1, при t° 37°), в чистый парафин (две порции, при t° 55—56°). Парафин быстро охлаждают, кусочек ткани с окружающим его парафином вырезают в виде так наз. блока. При заливке в парафин и изготовлении блоков можно пользоваться специальными рамками, позволяющими регулировать размер и форму блоков. Вместо ксилола можно использовать толуол, бензол, хлороформ, а также касторовое масло. В качестве промежуточной пропитывающей среды часто "используют диоксан, а для обезвоживания — бутиловый, изобутиловый или пропиловый спирты, амилацетат и т. п. Заливка в парафин позволяет получить достаточно тонкие, пригодные для световой микроскопии срезы (от 5—8 мкм и до 1—2 мкм). При заливке в целлоидин обезвоженный в спиртах кусочек органа или ткани переносят в смесь 100% спирта и эфира (1 : 1), после чего пропитывают спиртоэфирными р-рами целлоидина возрастающей концентрации (от 2 до 8%). Затем кусочек в виде блока в деревянных или пластмассовых рамках выдерживают в парах хлороформа до затвердевания целлоидина и помещают в 70% спирт, где препарат приобретает плотность хряща и может храниться долгое время. Целлоидиновые срезы легко режутся на микротоме и хорошо окрашиваются большинством красителей, однако толщина их больше, чем у парафиновых срезов. Иногда используют прием дополнительной заливки пропитанных целлоидином кусочков в парафин (заливка в целлоидин-парафин), что позволяет соединить преимущества обоих методов. Время обезвоживания, пропитывания в промежуточных и заливочных средах подбирают для каждого конкретного исследования. Все более широкое применение находят для заливки тканей синтетические смолы (аралдит, эпон и т. д.), особенно при изготовлении срезов для электронной микроскопии. Изготовленные срезы для дальнейшей обработки обычно наклеивают на предметные стекла. Замороженные и целлоидиновые срезы можно не наклеивать на предметные стекла, а переносить из одного р-ра в другой с помощью препаровальной иглы и т. п. Перед наклейкой парафиновых срезов на обезжиренные, чисто вымытые предметные стекла наносят тонкий слой смеси глицерина с куриным белком (1:1) и нагревают для денатурации белка. Затем в капле дист, воды на предметном стекле расправляют парафиновые срезы, слегка их подогревая. Избыток воды удаляют и стекла со срезами высушивают при t° 37—40° в термостате. Перед окраской или исследованием препаратов в неокрашенном виде из срезов удаляют парафин путем последовательного помещения препаратов в р-ры ксилола и спиртов понижающейся концентрации (от 100 до 40%). При использовании целлоидиновых срезов, как правило, не требуется специальных процедур удаления целлоидина — срезы проводят, минуя ксилол, через ряд спиртов понижающейся концентрации (вплоть до воды) и окрашивают.

Окрашивание фиксированных гистологических (цитологических) объектов служит для выявления (контрастирования) различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители (см.) в зависимости от физ.-хим. свойств. Результаты окраски в значительной степени зависят от предшествующей обработки объекта (фиксации, заливки и т. п.). Гистол, окраска — сложный процесс, в к-ром играют роль многие физ.-хим. факторы, связанные со свойствами как красителя, так и окрашиваемого объекта. Гистол, красители классифицируют по источникам получения (натуральные и синтетические), по хим. строению (азокрасители, хинонимидные и т. д.), по способу использования (протравные и т. п.), возможности избирательно окрашивать объект (ядерные, цитоплазматические и т. п.) и по другим свойствам. По наиболее распространенной классификации красители подразделяют на основные, кислые, нейтральные и индифферентные. Основные красители представляют собой красящие основания или чаще их соли (метиленовый синий, толуидиновый синий, азуры, тионин, а также гематоксилин, бисмарк коричневый и др.). Окрашиваемые ими структуры называют базофильными (см. Романовского-Гимзы метод) и др. Наконец, красящие свойства индифферентных красителей связаны с их способностью растворяться в определенных веществах. Так, напр., судан III или шарлах-рот хорошо растворяются только в жирах и вследствие этого избирательно окрашивают их в красно-оранжевый цвет.

Способы (механизмы) окрашивания гистологических структур весьма многообразны. Существующие теории (химическая, электроколлоидальная, физико-химическая, обменной адсорбции) касаются какого-то одного из механизмов окрашивания, но не охватывают всего многообразия связывания красителей со структурами клеток и тканей.

От окраски в собственном смысле слова отличают импрегнацию (см.) — специальный метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (напр., серебра, свинца, осмия, золота).

Заключение препаратов в среды

Изготовление гистологических препаратов обычно заканчивается заключением их в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этой цели применяют канадский бальзам (см.) — особый вид смолы, растворимый в ксилоле, толуоле и бензоле. Хорошо промытые после окраски или фиксации препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси кристаллической карболовой к-ты (1 часть) и ксилола (3 части) и помещают в две порции чистого ксилола. Затем на препарат наносят каплю р-ра канадского бальзама (на ксилоле, толуоле или бензоле и др.) и покрывают покровным стеклом. После высыхания растворителя бальзам затвердевает, и препарат можно многократно использовать для микроскопирования. Существует много заменителей канадского бальзама (пихтовый бальзам, даммаровая смола, цедакс, полистирол и т. д.). В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом и другими реактивами, растворяющими краситель или окрашиваемое вещество (напр., жиры) , используют водорастворимые среды (глицерин, желатину или их смеси). При применении плохо затвердевающих заключающих сред (напр., глицерина) края покровного стекла обычно окантовывают расплавленным парафином, менделеевской замазкой и т. п.

Специальные методы исследования

Из методов, применимых обычно к фиксированным клеткам и тканям или их компонентам, следует упомянуть гисторентгенографию (см. Авторадиография). Гисторентгенография основана на исследовании поглощения рентгеновских лучей структурами микрообъектов; напр., можно получить количественные данные о содержании кальция в различных участках кости и т. п. Рентгеноструктурный анализ (метод дифракции рентгеновских лучей) нашел широкое применение в исследовании органических кристаллов. В частности, с помощью этого метода изучена молекулярная структура коллагена, гемоглобина, ДНК, миоглобина и пр. Автогисторадиография — это метод регистрации радиоактивного распада в тканевых, клеточных структурах фотографическим способом. Метод широко используют в исследованиях клеточного метаболизма, а также как прием изотопной маркировки клеток при изучении их дифференцировки, возможных трансформаций и т. д.

В ряде гистологических исследований применяют макро-, микроскопические методы, предназначенные для изучения структур, находящихся на грани макроскопических и микроскопических величин. В таких исследованиях обычно используют бинокулярный (стереоскопический) микроскоп (лупу). Примером макромикроскопических методов может служить микротрахископия, разработанная М. А. Бароном (1949). Кусочки органов и тканей (обычно размером 1,5 X 1,5 см и толщиной не менее 3—4 мм) после фиксации и окраски разрезают параллельно поверхности на две части, так что препараты толщиной 1,5—2,0 мм оказываются окрашенными лишь с одной стороны. Полученные пластинки наклеивают неокрашенной стороной на целлулоид и просветляют в растворах глицерина и уксуснокислого калия возрастающих концентраций. Препарат заключают в прозрачную среду (глицерин, канадский бальзам и др.), помещают на вогнутое сферическое зеркало и рассматривают в бинокулярный микроскоп (лупу) при падающем и боковом (проходящем) свете. Метод позволяет изучать трехмерную топографию структур органов и тканей. При использовании соответствующих увеличений (объективов) удается наблюдать и микроскопические структуры — такие, как ядра клеток и даже ядрышки.

Гистологические методы исследования постоянно совершенствуются, появляются новые методы, основанные на использовании достижений оптики, физики, химии, молекулярной биологии и др. Широко используются методы гистохимии; электронная микроскопия позволяет исследовать все более мелкие структуры клеток. Совершенствуются также методы непосредственного наблюдения живых клеток и тканей, их культивирования, микрургические приемы. Постоянно развиваются и методы объективной регистрации микроскопических наблюдений, такие, как микрофотография, цейтраферная микрокиносъёмка.

Методические вопросы гистологии и цитологии освещаются во многих отечественных («Архив анатомии, гистологии и эмбриологии», «Архив патологии», «Лабораторное дело», «Онтогенез», «Цитология» и др.) и зарубежных [American J. Anatomy; Anatomical Record, J. Anatomy (London), J. Cell Biology; J. Histochemistry and Cytochemistry и др.] журналах.

Аппараты для гистологических исследований

В целях подготовки материала для гистологических работ и исследования препаратов применяют термостаты (см.), нагревательные столики и устройства для автоматизации анализа морфологических структур.