БЛИЗНЕЦОВЫЙ МЕТОД

Близнецовый метод — исследование генетических закономерностей на близнецах. В основе Близнецового метода лежит сравнение изучаемых признаков (или реакций) в разных группах близнецов с учетом сходства или различий их генотипов (см.) и среды, в к-рой близнецы росли, т. е. оценка роли наследственности и среды в изменчивости признака.

Частным случаем использования Близнецового метода являются, напр., установление наследственного характера признака и определение частоты фенотипического проявления гена — его пенетрантности (см. Пенетрантность гена). Б. м. применяется также и для оценки действия некоторых внешних факторов: лечебных препаратов, методов воспитания, обучения и т. д. В целом близнецовые исследования, кроме Б. м., включают еще изучение явления многоплодия с медицинской, демографической, генетической и других точек зрения. Термин «близнецовый метод» был предложен Гальтоном (F. Galton) в 1875 г. В дальнейшей разработке этого метода принимали участие Вейнберг (W. Weinberg), Сименс (Н. Siemens), Хольцингер (К. Holzinger), Пенроуз (L. Penrose), Аллен (G. Allen), С. Г. Левит и другие, усилиями которых учение о близнецах превратилось в самостоятельный раздел биологии, называемый гемеллологией (лат. gemelli близнецы + греч, logos учение).

При использовании Близнецового метода проводится сопоставление: 1) монозиготных (однояйцовых) близнецов с дизиготными (двуяйцовыми); 2) конкретных представителей (партнеров) монозиготных пар между собой; 3) результатов анализа близнецовой выборки с общей популяцией.

Монозиготными близнецами (однояйцовые, идентичные близнецы) называют близнецов, развивающихся из одной оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) и разделившейся при первом дроблении зиготы на две части. Такие близнецы генетически одинаковы.

Дизиготные близнецы (двуяйцовые, неидентичные близнецы) возникают при одновременном оплодотворении двух яйцеклеток. С генетической точки зрения они сходны не более, чем обычные братья и сестры, и имеют в среднем по 50% идентичных генов. Однако у дизиготных близнецов совпадает время зачатия, время и условия эмбрионального развития в материнском организме и постэмбрионального — в семье, т. е. двуяйцовые близнецы обладают большей общностью средовых факторов, чем обычные братья и сестры.

При многоплодных беременностях рождаются не только двойни, но и тройни, четверни и т. д. Частота рождения таких близнецов не велика, и в Б. м. они используются редко.

Общая частота рождений близнецовых пар равна примерно 1%, из которых приблизительно около трети приходится на монозиготных близнецов. Соотношение моно- и дизиготных близнецов для каждой популяции можно определить по методу Вейнберга, суть к-рого в упрощенной форме сводится к следующему: отклонения от равного соотношения полов в близнецовых выборках невелики, все разнополые пары — заведомо дизиготны. Количество разнополых и равнополых пар среди дизиготных близнецов примерно одинаково. Поэтому число монозиготных близнецов можно определить, вычитая из всех обследованных пар близнецов удвоенное количество разнополых пар. Этот метод следует использовать только при популяционных исследованиях, т. к. в малых выборках он дает неточные результаты.

Исследования с применением Б. м. проводят в три этапа: 1) составление близнецовой выборки; 2) установление моно- или дизиготности; 3) сопоставление пар и групп близнецов по рассматриваемым признакам.

Составление близнецовой выборки. Из популяции выбираются все близнецы, а затем те из них, кто имеет рассматриваемый признак, или же из всего населения выделяются лица с данным признаком, а потом уже из них выделяют близнецов. В наблюдение должны включаться только те пары близнецов, в которых можно обследовать обоих партнеров.

Если популяция, в к-рой проводится исследование Б. м., велика и выявить всех близнецов в ней невозможно, то составление близнецовой выборки должно основываться на общих статистических правилах, включая правильное для данной популяции соотношение моно- и дизиготных пар. Б. м. не всегда требует большой выборки, и исследование можно ограничить одной или несколькими парами близнецов. В этом случае, однако, будет невозможна экстраполяция результатов на популяцию.

Диагностика зиготности близнецов

Первоначально диагностика зиготности основывалась на оценке количества плацент и хорионов. Однако, как было установлено позже, ошибки здесь могут достигать 20%, поскольку монозиготные близнецы могут иметь два хориона. Одновременно с этим зачастую просто невозможно получить эти сведения из истории родов. В 1924 г. Сименс предложил диагностировать зиготность близнецов методом так наз. полисимптомного сходства, т. е. сравнением партнеров пары по внешним признакам (пигментация кожи и волос, форма носа, губ, ушных раковин, рук, ногтей, размеры тела и т. д.). Субъективность этого метода заставила исследователей продолжить поиск других методов диагностики зиготности, включающих исследование сходства партнеров пары по четким, объективно учитываемым генетическим признакам (маркерам).

Современная диагностика зиготности основывается на анализе наиболее изученных и просто наследующихся признаков (эритро- и лейкоцитарные антигены, белки сыворотки крови, способность ощущать вкус фенилтиокарбамида и т. д.).

Для диагностики зиготности определяют следующие эритроцитарные и сывороточные системы крови: AB0, MNSs, Rh, P, Kell, Lutheran, Duffy, Kidd, Lewis, гаптоглобины, γ-глобулины, трансферрины и др. Зиготность близнецов точнее и быстрее можно установить, если известны группы крови и белков сыворотки крови родителей или кровных родственников — Генотип). В этом случае вероятность моно- или дизиготности рассчитывается на основании частоты проявления соответствующих признаков (маркеров) в популяции, к к-рой принадлежат родители.

Часто для диагностики зиготности приходится прибегать к исследованию и других показателей, из которых следует выделить четыре: дерматоглифику (см.), смешанную культуру лимфоцитов, пересадку кожи, электрофорез белков сыворотки крови.

Сходство дерматоглифических показателей у монозиготных близнецов значительно больше, чем у дизиготных. Этот факт известен давно, но метод не имел количественной оценки. Поскольку дерматоглифический метод исследования сейчас включает количественные показатели, которые можно оценивать интегрально, то его возможности как метода диагностики зиготности близнецов существенно возросли. Использование лимфоцитарного теста для диагностики зиготности основано на пролиферации лейкоцитов при смешении культур клеток от двух генетически неидентичных индивидов. Лимфоциты в смешанной культуре от монозиготных близнецов не претерпевают изменений, а от дизиготных способны трансформироваться. Это позволяет установить зиготность близнецов.

Наиболее точным показателем монозиготности близнецов является приживление реципрокно (от одного близнеца другому и наоборот) пересаженных кусочков кожи, т. к. успех трансплантации у человека определяется значительным числом генетически детерминируемых факторов. У дизиготных близнецов пересадки всегда заканчиваются отторжением. Однако этот тест в силу технической сложности и травматичности применяется относительно редко.

Предложен способ определения зиготности с помощью сравнения электрофореграмм сывороточных белков партнеров близнецовой пары, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле. Монозиготные близнецы показывают одинаковые полосы (фракции), дизиготные — различные.

В целом можно считать, что современные методы обследования дают широкие возможности для достаточно точного диагностирования зиготности близнецов.

Объединение Близнецового метода с популяционно-статистическими исследованиями требует изучения зиготности многих тысяч пар. Такая огромная выборка не может быть изучена описанными методами, и в этих случаях используют анкетный метод диагностики. Показано, что анкетирование в 80— 85% случаев позволяет правильно определить зиготность; ошибкой при массовых исследованиях можно пренебречь. Однако анкетный метод диагностики зиготности не должен применяться в малых выборках.

Сопоставление пар и групп моно- и дизиготных близнецов (или партнеров монозиготных пар) по изучаемому признаку является заключительным этапом применения Б. м.

Методы сравнения близнецовых выборок по качественным (дискретным) признакам (ахондроплазия, галактоземия и т. д.) и количественным (рост, вес, продолжительность жизни и т. д.) различны.

Какой-либо качественный признак может встречаться у обоих близнецов данной пары либо у одного из них. В первом случае пара называется конкордантной, во втором— дискордантной (если рассматриваемый признак отсутствует у обоих близнецов, то такая пара вообще не попадает под наблюдение).

При сопоставлении моно- и дизиготных близнецов для каждой из групп определяют степень парной конкордантности (Kn), указывающую на пропорцию пар, в которых оба партнера имеют изучаемые признаки. В зависимости от характера сбора материала расчеты степени парной конкордантности различаются.

Если в популяции изучены все близнецы, имеющие рассматриваемый признак, то парная конкордантность определяется отношением числа конкордантных пар к общему числу конкордантных и дискордантных пар:

где С — число конкордантных по признаку пар, D — число дискордантных пар.

Однако в большинстве случаев исследователь в связи с размерами популяции не в состоянии изучить в ней всех близнецов, и исследуемая группа составляется выборочно. При этом следует иметь в виду, что конкордантные по данному признаку пары имеют примерно в два раза больше шансов попасть в поле зрения специалиста, чем дискордантные. Кроме того, при выборочном учете с какой-то вероятностью окажутся пары, которые, несмотря на наличие изучаемого признака, не попадут под наблюдение и не будут изучены. Чтобы не было занижения степени конкордантности, делают поправку. Принимается, что вероятность нерегистрации пары равна вероятности регистрации обоих близнецов как носителей данного признака (пробандов), а этот показатель легко определяется из выборки. Для того чтобы избежать ошибок, связанных с этими методическими погрешностями, парную конкордантность при выборочном учете следует определять по формуле:

где X — число пар, в которых носителями признака были оба партнера.

При использовании Б. м. надо указывать, каким способом определялась парная конкордантность, и вычислять ее одинаково для моно- и дизиготных близнецов. Использование показателя парной конкордантности требует также коррекции в отношении возрастной структуры выборки, особенно в тех случаях, когда возраст является модификатором проявления признака, напр, при ряде наследственных заболеваний.

Сопоставление степени парной конкордантности у моно- и дизиготных близнецов дает приблизительный ответ на вопрос о соотносительной роли наследственности и среды в развитии признака. При этом исходным является положение, что степень парной конкордантности должна быть достоверно выше у моно-, чем у дизиготных близнецов в случае, если наследственные факторы играют доминирующую роль в возникновении изучаемых признаков или болезней. Если в формировании изучаемой особенности участвуют как генетические, так и негенетические факторы, то у монозиготных близнецов могут наблюдаться определенные внутрипарные различия. Чем больше влияние среды, тем значительнее будут эти различия. Соответственно будет уменьшаться разница в степенях парной конкордантности между моно- и дизиготными близнецами. Для вычисления доли (степени) наследственности, участвующей в развитии признака, используют формулу Хольцингера:

где H — доля (степень) влияния наследственности на фенотип, K_nMZ и K_nDZ — степени парной конкордантности моно- и дизиготных близнецов. H — выражается величинами от 0 (полное отсутствие значения наследственности) до 1 (полное отсутствие значения среды). Если признак определяется аллелем (см. Аллели) с полной пенетрантностыо при несущественном влиянии среды, то степень конкордантности монозиготных близнецов будет равна единице, а дизиготных — 0,5 или 0,25 в зависимости от доминантного или рецессивного типа наследования и генотипа родителей. При полной конкордантности монозиготных близнецов H будет равно 1,0. На самом деле такие значения H бывают лишь при изучении строго генетически детерминированных признаков (напр., групп крови) и наблюдаются редко, что обусловливается неточностью диагностики заболеваний и неправильным определением зиготности. В обоих случаях значение H будет занижено. В диагностике заболеваний чаще встречаются случаи гиподиагностики, чем гипердиагностики, а это в большей степени отражается на степени конкордантности монозиготных близнецов, чем дизиготных. Ошибки в диагностике зиготности обычно приводят к включению дизиготных близнецов в группу монозиготных. Это также может привести к уменьшению степени конкордантности монозиготных близнецов.

Учитывая возможные ошибки определения конкордантности и зиготности, а также основываясь на опубликованных результатах конкордантности близнецов при моно генных заболеваниях, можно говорить об определяющем значении наследственности в развитии признака при значениях H больше 0,7.

Существенное значение для экстраполяции данных близнецового анализа на общую популяцию имеет понятие «пробандовая (парная) конкордантность» (K_p) — относительное число носителей признака среди моно- или дизиготных близнецов, что соответствует понятию о пенетрантности. Пробандовая конкордантность изучается чаще всего среди монозиготных близнецов и вычисляется по формуле:

где С — число конкордантных по изучаемому признаку пар, зарегистрированных только по одному партнеру, C_x — число конкордантных пар, партнеры которых были зарегистрированы независимо друг от друга, D — число дискордантных пар. Если имеется полный учет всех пар, то формула (4) сводится к следующему виду:

Таким образом, основное значение пробандовой конкордантности монозиготных близнецов состоит в том, что (в случае, если сам факт монозиготности не влияет на проявление признака) она может рассматриваться как средняя пенетрантность генотипа, определяющего данный признак.

Преимуществом пробандовой конкордантности является возможность сравнения ее величины с частотой признака в популяции.

Между пробандовой конкордантностыо по данному признаку как средней пенетрантностью гена, частотой признака в популяции (Р) и отклонениями от средней пенетрантности V_р (включающей как генетическую, так и общую средовую вариабельность) имеется связь, выраженная формулой:

Т. о., формула (7) дает возможность получить представление (хотя и в определенном смысле условное) о величине вариабельности пенетрантности наследственного задатка, формирующего признак. Эта величина представляет интерес в плане дальнейшего изучения непосредственных причин пенетрантности (если признак полезен) и непенетрируемости (если признак патологичен) генетической детерминации признака. В этом смысле особая роль отводится сравнительному изучению дискордантных по признаку партнеров монозиготных пар. Сравнивая партнеров монозиготных пар, обладающих изучаемым признаком, с теми, у которых он отсутствует, и сопоставляя эти данные с другими выявленными у близнецов изменениями, а также с различными факторами внешней среды, можно получить ответ на вопрос о причинах дискордантности партнеров. В этом плане очень ценные сведения могут быть получены при сопоставлении дискордантных монозиготных близнецов, воспитывающихся раздельно, однако такие пары встречаются редко.

При изучении роли наследственности и среды в формировании количественных признаков сходство или различие близнецов не может быть выражено терминами «конкордантность» или «дискордантность». Степень их различия выражается каким-то размахом величин, который определяется наследственностью и средой у дизиготных близнецов и только средой у монозиготных. Для упрощения можно не учитывать различия во взаимодействии генов и среды у разных типов близнецов, а также различия среды, которые в определенной степени имеют место у тех и других. В таком случае разница в величинах дисперсии признака у дизиготных близнецов по сравнению с монозиготными будет отражать относительное значение наследственных факторов по сравнению со средовыми в изменчивости признака, вследствие чего приведенная выше формула Хольцингера принимает вид:

где S_2DZ и S_2MZ — соответственно диспрсии признака у дизиготных и монозиготных близнецов; II отражает долю дисперсии фенотипа за счет наследственности.

Помимо сравнения моно- и дизиготных близнецов, для оценки роли среды можно использовать сравнение монозиготных близнецов, воспитывающихся вместе и раздельно. В этом случае определяют долю дисперсии фенотипа (E), обусловленную средой, с помощью коэффициентов внутриклассовой корреляции по следующей формуле:

где r_(MZB) и r_(MZP) - внутриклассовые корреляции вместе (MZB) и раздельно (MZP) воспитанных монозиготных близнецов.

Другая категория проблем, решаемых Б. м.,— это исследование эффективности различных лекарственных препаратов, установления оптимальных методов воздействия, доз и т. д.

Применение Б. м. с целью сравнительного изучения разных методов воздействия у монозиготных близнецов, разделенных на две группы, позволяет чрезвычайно экономно, на небольшом числе наблюдений, получать убедительные данные, указывающие на преимущество одного метода (или лечебного препарата) перед другим. При этом один партнер каждой нары близнецов подвергается исследуемому воздействию, а другой служит контролем. Принимая во внимание идентичность генотипа монозиготных партнеров, можно полагать, что контроль в этом случае является наиболее совершенным из всех возможных. Применяется также и другой вариант, а именно: один из партнеров пары подвергается одному, а другой партнер — другому методу воздействия.

Варианты применения Б. м., аналогичные приведенным, имеют место как в медицине, так и в биологии, психологии, антропологии, педагогике и многих других областях науки о человеке.

Близнецовый метод имеет ряд серьезных недостатков. связанных в первую очередь с неполнотой сведений о пре- и постнатальном развитии близнецов. Напр., при Б. м. принимается, что среда в широком смысле одинакова для моно- и дизиготных близнецов.

Но это не совсем так. Во многих отношениях монозиготные близнецы обладают большим сходством, чем дизиготные. Они чаще выбирают себе одни и те же игры, товарищей. С ними одинаково обращаются родители. К тому же нельзя считать одинаковыми условия внутриутробного развития моно- и дизиготных близнецов. В частности, известны сосудистые анастомозы между близнецами, в первую очередь оказывающие влияние на развитие дизиготных близнецов, которые могут иметь генетически различные ткани, в частности клетки крови (см. Химеры). Возможен и ряд других различий между близнецами, возникающих на пре- и постнатальной стадиях развития.

Взаимодействие генов и среды не учитывается как возможный фактор различия близнецов. Между тем его эффекты могут быть выраженными, причем различия у дизиготных близнецов будут большими, чем у монозиготных. На развитие монозиготных близнецов могут оказывать влияние как соматические мутации, так и различия в степени активации генома (см.). Так, описаны монозиготные близнецы-сестры с нормальным кариотипом, одна из которых страдала гемофилией, а другая была гетерозиготной носительницей без проявления. Полагают, что дискордантность возникла в связи с тем, что на ранней стадии развития у партнерш инактивировались (эффект Лайон) разные X-хромосомы.

Некомпетентное использование Б. м., связанное с недостоверной диагностикой зиготности близнецов, неправильным составлением близнецовой выборки или недостаточным ее объемом, тенденцией к выборочному описанию «интересных» случаев, резко снижает эффективность Б. м., приводит к поверхностным, недостоверным выводам.

Оценивая Б.М. в целом, следует сказать, что он наряду с другими методами генетики выполнил свою задачу, навсегда утвердив в сознании врачей, генетиков, антропологов, психофизиологов, педагогов ту непреложную в наст, время истину, что практически любой признак человеческого организма в той или иной степени детерминируется генетической конституцией. Однако вопросы точной количественной оценки изменчивости многих признаков за счет генотипа и среды остались неразрешенными. То же относится и к исследованию с помощью Б. м. тонких механизмов влияния среды на развитие признаков.

В близнецовых исследованиях наметились сдвиги, связанные с использованием Б.М. в сочетании с другими методами генетического анализа (популяционно-статистическим, биохимическим и т. д.). Напр., синхронность реализации генотипа монозиготных близнецов в фенотип открывает определенные возможности в изучении генетики развития, в частности при условии совместного использования Б.М. с методами генетики соматических клеток (см.).

Т. о., перспективы дальнейшего применения Близнецового метода связаны, с одной стороны, с оценкой и пониманием тех искажений, которые возникают за счет биологических и статистических факторов при сравнении близнецов, а с другой — с объединением Б. м. с другими методами современной генетики.

См. также Медицинская генетика.

Библиография: Канаев И. И. Близнецы, М.— Л., 1959, библиогр.; Левит С. Г. Некоторые итоги и перспективы близнецовых исследований, Труды Медико-биол. науч.-исслед. ин-та, т. 3, с. 5, М.— Л., 1934; Мартынова Р. П. и Рыбкин И. А. Исследования близнецов в медицинской генетике, в кн.: Пробл, мед. генетики, под ред. В. П. Эфроимсона и др., с. 113, М.— Варшава, 1970, библиогр.; Ниль Дж, В. и Шэлл У. Дж. Наследственность человека, пер. с англ., М., 1958; Allen G. Twin research, problems and prospects, Progr. med. Genet., v. 4, p. 242, 1965, bibliogr.; Allen G., Harva Id B. a. Shields J. Measures of twin concordance, Acta genet. (Basel), v. 17, p. 475, 1967; Cederlof R. a. o. Studies on similarity diagnosis in twins with the aid of mailed questionnaires, ibid., v. 11, p. 338, 1961; Edwards J. H. Multiple pregnancy, the value of twins in genetic studies, Proc. roy. Soc. Med., v. 61, 227, 1968; Martynova R. P. Some considerations about twin zygosity and concordance determination in cancer research, Acta Genet, med. (Roma), v. 19,p. 19, 1970.

Η. П. Бочков, E. Т. Лильин, Р. П. Мартынова.