СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ — область измерительной техники, разрабатывающая методы и приборы для определения спектральных характеристик объектов. В медико-биологических исследованиях наибольшее значение имеет анализ молекулярных и атомных спектров поглощения (см. Спектроскопия). С помощью Спектрофотометрии определяют в различных биол. пробах содержание ферментов, гормонов, белков, витаминов, многих неорганических веществ, анализируют качественный и количественный состав мазков крови и т. д.

В основе Спектрофотометрии лежит регистрация степени ослабления монохроматического пучка света при его прохождении через вещество (закон Бугера— Ламберта — Беера: lg(I₀/I) = E*c*d, где I₀ и I — интенсивность света соответственно до и после его прохождения через слой вещества; с — концентрация вещества, поглощающего свет; d — толщина слоя; Е — коэффициент, зависящий от длины волны падающего света и природы вещества). Отношение интенсивности прошедшего света и интенсивности падающего (Т = 1/10) называют пропусканием. Обычно эту величину выражают в процентах от интенсивности падающего света. На практике часто используется также величина логарифма пропускания, взятая с обратным знаком (D = -lgT = E*c*d) — так наз. оптическая плотность, величина к-рой линейно связана с концентрацией вещества. Если величина с выражена в молях на литр, d — в сантиметрах, то Е называют молярным коэффициентом поглощения или молярным коэффициентом экстинкции. Он характеризует вероятность поглощения веществом электромагнитной энергии и численно равен оптической плотности раствора (D) толщиной 1 см и с концентрацией вещества, равной 1 моль на 1 л.

Закон Бугера — Ламберта — Беера справедлив лишь для плоскопараллельного пучка монохроматического света и при выполнении ряда условий. На практике часто приходится сталкиваться с отклонениями от этого закона. К числу причин отклонения могут быть отнесены физ.-хим. свойства анализируемого вещества или всего раствора (диссоциация, флюоресценция и др.)» инструментальные факторы (напр., отсутствие должной степени монохроматичности пучка света), факторы, обусловленные неоднородностью изучаемого объекта в пучке света (особенно отчетливо проявляется при микроспектрофотометрии объектов) и т. д.

Важным принципом С. является принцип аддитивности (т. е. суммации) оптических плотностей, в соответствии с к-рым величина оптической плотности смеси соединений, подчиняющихся закону Бугера — Ламберта — Беера и не вступающих в хим. взаимодействие друг с другом, равна сумме оптических плотностей этих соединений.

Количественный анализ пробы, содержащей одно вещество, включает следующие операции: 1) регистрацию полного спектра поглощения вещества (D измеряют как функцию длины волны λ), выбор аналитической длины волны (λ_анал); 2) приготовление 6—7 эталонных (стандартных) р-ров, охватывающих весь ожидаемый диапазон концентраций определяемого вещества в анализируемых р-рах, и измерение оптической плотности (D_ст) этих растворов при λ_анал. Затем строят график зависимости величины оптической плотности D_ст от концентрации эталонного р-ра. Наиболее точные результаты дают измерения в диапазоне D в пределах 0,05—1,50. В случае, если построенная зависимость, т. е. D_cт = f(c_ст), линейна (определяемое вещество подчиняется закону Бугера — Ламберта — Беера), определение концентрации вещества осуществляют аналитически, используя формулу с = с_ст*(D/D_ст). При несоблюдении закона Бугера — Ламберта — Беера количественный анализ проводят графическим методом (с помощью калибровочного графика). Оптическая плотность анализируемого р-ра во всех случаях измеряется относительно р-ра сравнения (прямой спектрофотометрический метод). В качестве р-ра сравнения может быть использован как чистый растворитель, так и р-р, содержащий все компоненты анализируемого р-ра за исключением определяемого вещества. В ряде случаев в качестве р-ра сравнения целесообразнее использовать р-р определяемого вещества известной концентрации (обычно более низкой, чем в анализируемых пробах). При проведении такого рода измерений говорят о дифференциальной С.

Нередко проводят регистрацию производных спектров поглощения. Производную С. применяют в основном в качественном анализе с целью выявления сильно перекрывающихся спектральных линий, при определении точного положения максимума размытых полос поглощения, идентификации малопоглощаю-щих примесей, установлении структуры органических соединений и т. д.

С. проводится в инфракрасной (ПК), УФ и видимой областях спектра. К приборам, работающим в видимой области, относятся также спектрофотометры комбинационного рассеяния (КР-спектрофотометры). С помощью С. комбинационного рассеяния изучают колебательные энергетические уровни молекул (см. Молекула), к-рые могут быть использованы для определения числа S — S-связей в белках, числа спаренных и неспаренных оснований в нуклеиновых к-тах, относительного содержания альфа- и бета-спирализованных участков в полипептидах и др.

С. микрообъектов, или микроспектрофотометрия, — относительно самостоятельная область исследования (см. Микроспектральный анализ). Микроспектрофотометры, как и микроспектрофлюориметры, обычно предназначены для работы в видимой области спектра, реже в УФ-области и выполняются по одно лучевой схеме. Для регистрации распределения поглощающего вещества по площади микрообъекта используют различного рода сканирующие устройства: систему оптических зондов, перемещающиеся по заданной программе предметные столики, телевизионную (электронную) развертку изображения и проч. Приборы совр. конструкций снабжаются микрокомпьютерами, автоматически обрабатывающими получаемую информацию и позволяющими анализировать форму микрообъектов (напр., при автоматическом анализе мазков крови), и др. В проточных микрофлюориметрах проводится скоростной анализ флюоресцентных характеристик индивидуальных клеток крови, окрашенных соответствующими красителями. Наметилась тенденция к разработке узкоспециализированных микроспектрофотометров и микроспектрофлюориметров, предназначенных для работы в условиях клин, лабораторий.

Атомарные спектры поглощения изучают с помощью пламенных спектрофотометров (см. Фотометрия). Атомно-абсорбционные методы дают возможность определения практически всех элементов периодической системы и отличаются высокой избирательностью и чувствительностью (до 10^-14 г).

Приборы для спектрального анализа комплектуются электронными устройствами обработки и управления, блоками автоматической подачи проб, самописцами, блоками цифро-печати, устройствами автоматической развертки спектра, позволяют определять в одной пробе несколько элементов.

С. широко применяется в биол. исследованиях. Она используется для количественного определения самых разнообразных биол. соединений: ферментов, витаминов, гормонов, белков и других азотистых веществ, нуклеиновых к-т, углеводов, спиртов, альдегидов, фенолов, кетонов, органических к-т, липидов, пигментов, ряда неорганических веществ (напр., натрия, калия, кальция, железа, цинка, хлора, серы) и др.

Приборы

Основными узлами спектрофотометров обычно являются: источник излучения; монохроматор, предназначенный для выделения из спектра излучения источника узких спектральных интервалов; приемник излучения; отсчетное устройство. Спектрофотометры подразделяются на однолучевые и двухлучевые, нерегистрирующие и регистрирующие. Распространенные в мед. лабораториях однолучевые нерегистрирующие спектрофотометры представляют собой достаточно простые и дешевые приборы с оптикой из оптического стекла или кварца. Использование кварцевой оптики дает возможность проводить измерения в области 200—1100 нм, охватывающей ультрафиолетовый, видимый и ближний инфракрасный участки спектра. Исследуемый образец и эталон последовательно вводят в световой пучок. Результаты сравнения пучков в величинах пропускания (в %) или оптической плотности (D) указываются на стрелочном или цифровом приборе.

Оптическая схема спектрофотометров чаще всего автоколлимационная. Источником света обычно служит водородная лампа (для работы в области спектра 220—320 нм) или лампа накаливания (для работы в области спектра 320—1100 нм). Луч света через систему зеркал попадает на диспергирующую призму, к-рая разлагает его, образуя спектр. Вращая призму, можно получать на выходе монохроматора свет волн различной длины; затем лучи проходят эталон (образец) и попадают на регистратор — светочувствительный слой фотоэлемента. Оценка производится либо с помощью калибровочного графика, либо на основе построения функциональной зависимости между величинами оптической плотности и длины волны.

К однолучевым нерегистрирующим спектрофотометрам относятся спектрофотометры СФ-4, СФ-4А, СФД-2, СФ-16, СФ-26. В частности, спектрофотометр СФ-26 имеет расширенный в ультрафиолетовой области (до 186 нм) спектральный диапазон, высокое разрешение в ультрафиолетовой области спектра и обеспечивает по сравнению с аналогами лучшую сходимость результатов измерения коэффициентов пропускания. Диапазон измерения коэффициента пропускания от 0 до 100%. Основная погрешность градуировки шкалы волн в ультрафиолетовой области 0,1 нм, в видимой области 0,5 нм, в ближней инфракрасной области 5,0 нм.

В двухлучевых регистрирующих спектрофотометрах поток от источника излучения разделяется на два пучка: основной и пучок сравнения (эталонный). В основной пучок устанавливается исследуемый образец, в пучок сравнения — эталон. При измерениях коэффициента пропускания веществ в растворе обычно используют две идентичные кюветы, одна из к-рых заполняется исследуемым образцом, а другая эталоном.