РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК; син.: реакция потребления, реакция фиксации, реакция отклонения комплемента, реакция фиксации алексина, активация системы комплемента, реакция Борде—Жангу) — иммунологическая реакция определения антител по известному антигену или антигенов по известному антителу, основанная на способности антител, входящих в состав иммунных комплексов, связывать комплемент. РСК впервые описана в 1901 г. Ж. Борде и Жангу (О. Gengou).

РСК нашла преимущественное применение при серодиагностике бактериальных и вирусных инфекций, а также в суд.-мед. экспертизе. Количественные методы РСК применяют в научных исследованиях для изучения реакции антиген — антитело (см. Антиген — антитело реакция).

Согласно современным представлениям бактериолиз (см.), сенсибилизированных гомологичными антителами. По данным Карпентера (Ph. Carpenter, 1975), напротив, связывание комплемента иммунными комплексами, антиген в к-рых представлен растворимыми соединениями, а также грамположительными бактериями, не приводит к видимым последствиям. Однако в результате активации компоненты комплемента претерпевают необратимые изменения и теряют первоначальные свойства, в частности способность лизиро-вать сенсибилизированные эритроциты. РСК основана на этих закономерностях активации комплемента.

РСК — двухфазная реакция. В первой фазе реакции искомый антиген (или антитело) смешивают с диагностической сывороткой крови (или антигеном-диагностикумом) в присутствии комплемента и смесь выдерживают нек-рое время для завершения реакции. Во второй (индикаторной) фазе реакции смесь инкубируют с гемолитической системой, состоящей из эритроцитов барана, сенсибилизированных анти-эритроцитарной (гемолитической) сывороткой. Если в первой фазе реакции образуется иммунный комплекс, т. е. искомые антиген или антитело присутствуют в смеси, то происходит связывание комплемента и прибавленные к смеси во второй фазе реакции сенсибилизированные эритроциты не лизируются. Если иммунный комплекс не образовался, то оставшийся свободным комплемент обусловливает лизис сенсибилизированных эритроцитов. Т. о., гемолиз во второй фазе реакции свидетельствует об отсутствии искомых антигена или антитела.

РСК имеет преимущества перед другими серологическими реакциями. С ее помощью можно зарегистрировать образование иммунного комплекса в тех случаях, когда видимые проявления реакции антиген — антитело, такие как антигены (см.). Благодаря высокой чувствительности, в 100—200 раз превышающей чувствительность реакции преципитации, в РСК анализируют системы с низким содержанием антигенов и антител.

В РСК участвуют пять компонентов: антиген (неизвестный или диагностический), сыворотка (испытуемая или диагностическая), комплемент, эритроциты, гемолитическая сыворотка. Объем, концентрация и соотношение этих компонентов оказывают существенное влияние на связывание комплемента в первой фазе РСК и на его гемолитическую активность во второй фазе реакции. Функциональная активность комплемента определяется также рядом факторов окружающей среды: температурой, концентрацией водородных ионов в р-ре, содержанием в нем одно- и двухвалентных катионов и анионов. Установлены оптимальные условия для проведения РСК: изотонический р-р хлорида натрия, доведенный до pH 7,4 вероналом или три-этиленамином, с ионной силой 0,147, содержащий 0,15 ммоль хлорида кальция и 0,5 ммоль хлорида магния; показано, что наиболее полно комплемент фиксируется иммунными комплексами при t° ок. 4° в течение 18—20 час. Этот прием широко используется в научных исследованиях и при серодиагностике бактериальных и вирусных инфекций.

Существуют многочисленные модификации РСК. Основным методическим требованием при использовании каждой из методик является точное соблюдение выбранных условий реакции, стандартизация компонентов реакции в предлагаемых условных единицах и соблюдение определенных количественных отношений между компонентами реакции.

Компоненты реакции связывания комплемента и принципы их стандартизации

Эритроциты.

Обычно используют эритроциты барана. Для их получения кровь барана берут стерильно в равный объем модифицированного р-ра Олсвера или консерванта крови 7Б. В день опыта отобранную стерильно из консерванта и отмытую буфером порцию эритроцитов используют для приготовления стандартной суспензии. Кабат и Мейер (E. A. Kabat, М. М. Мауег, 1968) предлагают использовать в качестве стандартной суспензию, содержащую в 1 мл 1*10⁹ эритроцитов. Оптическая плотность (OD) лизата, приготовленного путем разведения в 15 раз стандартной суспензии 0,1% р-ром Na₂CO₃, определенная на спектрофотометре при длине волны 541 нм в кювете с оптическим ходом 1 см, оказывается равной 0,700. Для доведения заранее приготовленной 5% суспензии эритроцитов до стандартной концентрации проводят расчет по формуле:

V2 = V1(ОD/0,7),

где OD — оптическая плотность лизата приготовленной 5% суспензии, V1 — объем приготовленной 5% суспензии, V2 — объем, к к-рому должна быть приведена 5% суспензия для получения стандартной концентрации эритроцитов.

Гемолитическая сыворотка (гемолизин, амбоцептор) — сыворотка крови кроликов, иммунизированных суспензией эритроцитов или стромой эритроцитов барана. Перед употреблением гемолитическая сыворотка для инактивации содержащегося в ней комплемента должна быть прогрета при f 56° в течение 30 мин. За титр сыворотки принимают ее наибольшее разведение, дающее полный гемолиз определенной дозы стандартной суспензии эритроцитов в присутствии постоянного количества комплемента в стандартных условиях опыта.

Гемолитическую систему готовят, приливая к стандартной суспензии эритроцитов равный объем гемолитической сыворотки в разведении, превышающем ее титр в три-четыре раза. Гемолитическую систему употребляют в день опыта.

Комплемент. Источником комплемента служит обычно сыворотка крови морских свинок. Для предотвращения инактивации комплемента свежеприготовленную сыворотку крови следует лиофилизировать или хранить при t° ниже —50°. Активность комплемента сохраняется в течение нескольких недель при t° 3—5° в присутствии борной к-ты и сернокислого натрия.

В РСК используют дозированное количество комплемента, к-рое принято измерять в условных 100% или 50% гемолитических единицах (СН₁₀₀, СН₅₀), равных количеству комплемента, обусловливающему соответственно 100% или 50% лизис определенной порции стандартной гемолитической системы в стандартных условиях опыта. Зависимость гемолиза от количества введенного в реакцию комплемента графически выражается S-образной кривой. При этом 100% гемолиз находится в зоне, где сенсибилизированные эритроциты недостаточно чувствительны к прибавлению новых порций комплемента; 50% гемолиз соответствует средней части кривой, где степень лизиса сенсибилизированных эритроцитов резко изменяется при изменении количества использованного в реакции комплемента. На основании этих данных для количественного выражения гемолитической активности комплемента целесообразно использовать СН₅₀. Активность комплемента в СН₅₀ может быть вычислена но одной экспериментальной точке в зоне частичного гемолиза с помощью таблицы, составленной с использованием формулы Крога. Формула Крога отражает зависимость между количеством фиксированного в опыте комплемента (X) и процентом гемолиза (у):

X = (y/[1-y])^0,2

Процент гемолиза определяют по шкале гемолиза, приготовленной из лизата стандартной суспензии эритроцитов, лизированной тройным объемом воды.

Антигены. Используемые в РСК антигены должны быть проверены на отсутствие антикомплементарности и гемотоксичности, т. е. не должны связывать комплемент в отсутствие антител и лизировать эритроциты.

Антисыворотки перед употреблением должны быть прогреты при t 56° в течение 30 мин. для инактивации содержащегося в них комплемента и сорбированы эритроцитами для удаления естественных гемолизинов.

Методы определения антигенов и антител

Методы определения антигенов и антител могут быть условно разделены на две основные группы — серологические и количественные. Серологические методы РСК используют для диагностики различных инфекционных заболеваний. В целях диагностики в исследуемых сыворотках крови можно определять антиген с помощью диагностической сыворотки. Однако чаще в сыворотке крови больных или реконвалес-центов определяют специфические антитела, используя антигены-диагностикумы (см. Диагностикумы).

При постановке РСК с целью стандартизации условий реакции используют так наз. рабочие дозы комплемента и антигена, к-рые подбирают непосредственно перед постановкой основного опыта. В качестве рабочей дозы комплемента употребляют обычно 1,25—1,5 СН₁₀₀ или 3—5 СН₅₀ комплемента. В качестве рабочей дозы антигена в нек-рых методиках используют его максимальное количество, к-рое не обладает антикомплементарностью. Ряд исследователей выявили зональный характер РСК и установили, что титр антисыворотки зависит от взятого в реакцию количества антигена. Избыток его, как и недостаток, приводит к занижению титра антисыворотки. Поэтому для каждой серологической системы необходимо определить оптимальную дозу (или диапазон доз) антигена, при к-рой реакция с исследуемой сывороткой выявляет ее максимальный титр. Обычно ее подбирают, титруя разведения антигена с постоянным количеством заведомо положительной сыворотки и рабочей дозой комплемента. Максимальное разведение антигена, связывающее комплемент, называют антигенной единицей. В качестве рабочей дозы при титровании сывороток используют 2—4 антигенные единицы.

При постановке основного опыта равные объемы увеличивающихся разведений титруемой сыворотки крови смешивают с рабочими дозами антигена и комплемента. Одновременно с опытными пробами ставят контроли антигена и сыворотки на антикомилементарность и контроль комплемента. Опытные и контрольные пробы инкубируют при t° 37° в течение 60 мин. или при t° 4° — 18—20 час., после чего ко всем пробам приливают одинаковое количество гемолитической системы и пробы вновь инкубируют при t° 37° в течение 60 мин. При наличии специфических антител в исследуемой сыворотке крови в опытных пробах по сравнению с контрольными наблюдается задержка гемолиза. За титр исследуемой сыворотки крови принимается ее наибольшее разведение, при к-ром наблюдается задержка гемолиза. При определении в РСК антигена серию его разведений смешивают с диагностической антисывороткой (неразведенной или разведенной в незначительной степени) и рабочей дозой комплемента. Рабочую дозу диагностической сыворохки предварительно не подбирают, т. к. показано, что титр антигена не определяется использованным разведением диагностической сыворотки.

Введение СН₅₀ комплемента позволило разработать количественные методы РСК, по точности не уступающие методу количественной преципитации. В основе количественной модификации РСК лежит прием обратного титрования комплемента, предложенный независимо Мейером с соавт. в 1948 г. и А. Кониковым в 1953 г. Сущность его заключается в том, что при постановке РСК во все опытные и контрольные пробы вносят одинаковое заведомо избыточное количество комплемента. После завершения фазы связывания комплемента (60 мин. при t° 37° пли 18—20 час. при t° 4°) в опытных и контрольных пробах титруют оставшийся несвязанным комплемент, выражая его количество в CH₅₀. Количество специфически связанного серологической системой комплемента определяют по разнице между свободным комплементом в контрольных и опытных пробах. Прием обратного титрования позволяет работать с антикомплементарными препаратами антигенов и иммунных сывороток при условии, что их антикомп-лементарность будет перекрыта избытком вводимого в реакцию комплемента. При постоянном количестве антител зависимость связывания комплемента от количества введенного в реакцию антигена, выраженная графически, напоминает кривую образования специфического преципитата. Максимум связывания комплемента, как и максимум образования специфического преципитата, лежит в области оптимальных отношений антитела и антигена. В области избытка антигена наблюдается задержка связывания комплемента. Отношение антител к антигену в точке максимального связывания комплемента — величина постоянная для каждой серологической системы. На основании этой закономерности И. А. Тархановой, А. П. Кониковым и В. В. Акимовой (1957) был предложен количественный метод титрования антигенов в РСК по точке максимального связывания комплемента, аналогичный методам оптимальных пропорций для титрования антигенов и антител в реакциях преципитации и флоккуляции.

В области большого избытка антител обнаружена прямая зависимость между количеством связанного системой комплемента и количеством участвующего в реакции антигена, что было использовано рядом исследователей для количественного определения нек-рых антигенов в РСК.

Уодсворт и Молтейнер (Е. A. Wadsworth, F. Maltaner) и др. в 1938 г. и Райс (С. Е. Rice) в 1942 г. сообщили об обнаружении линейной зависимости между количеством связанного комплемента и содержанием антител в титруемой сыворотке в присутствии оптимального количества антигена. На этом основании было предложено выражать титр антисывороток отношением количества комплемента, необходимого для 50% гемолиза в присутствии иммунной сыворотки и оптимального количества антигена, к количеству комплемента, к-рое необходимо для 50% гемолиза в присутствии только иммунной сыворотки. Однако в более поздних работах была выявлена отчетливая гетерогенность антител одной и той же специфичности в отношении способности связывать комплемент, поэтому количество связанного иммунной сывороткой комплемента не может служить достаточно точной мерой содержания в ней антител.

Одной из модификаций РСК является непрямая РСК, или реакция задержки связывания комплемента, предложенная в 1948 г. Райсом для обнаружения антител в сыворотках крови птиц и нек-рых млекопитающих. Сыворотки крови этих животных после прогревания не связывают комплемент в обычной РСК, хотя, по данным других серологических тестов, содержат антитела, соединяющиеся с гомологичным антигеном. Принцип непрямой РСК состоит в конкурентном связывании антигена антителами, не обладающими компле-ментсвязывающей активностью, что препятствует его последующему связыванию комплементсвязывающими антителами той же специфичности, но от другого вида. Непрямая РСК применяется в ветеринарии для определения орнитоза у птиц и ящура у крупного рогатого скота.

Другой модификацией РСК являются активные методы РСК, в к-рых используют комплемент и естественные гемолизины, содержащиеся в исследуемых сыворотках крови. Преимущество активных методов перед обычной РСК — титрование непрогретых иммунных сывороток. Активные методы предназначены для определения антител, титры к-рых настолько низки, что они не определяются после температурной инактивации комплемента в исследуемых сыворотках. Впервые такой метод был описан в 1908 г. Н. А. Черногубовым. К активным методам можно причислить и реакцию потребления комплемента, в к-рой используют комплемент титруемой сыворотки, но в индикаторной фазе используют обычную гемолитическую систему. Активные методы применяют при диагностике сифилиса, определении ауто- и гомоантител.

См. также Серологические исследования.

Библиография:

Иммунохимический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, с. 79, М., 1968, библиогр.;

Калинин В. С. и Гинзбург С. И. Модификация реакции связывания комплемента и ее применение, М., 1946; Коников А. П. Модификация реакции связывания комплемента для количественного определения антигенов и антител, Журн. микр., эпид. и иммун., № 1, с. 57, 1953; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., М., 1968; Резникова Л. С. Комплемент и его значение в иммунологических реакциях, М., 1967, библиогр.; Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. X. Ходжаева, с. 316, М., 1973; Bordet J. е. Gengou О. Sur I’existence de substances sensibilisatrices dans la plupart de serums antimicrobiens, Ann. Inst. Pasteur, p. 289, 1901; Rice С. E. Some factors influencing selection of complement-fixa-tion method, J. Immunol., v. 59, p. 95, 1948; Wallace A. L., Osier A. G. a. Mayer М. M. Quantitative studies of complement-fixation, estimation of complement-fixing potency of immune sera and its relation to antibody-nitrogen content, ibid., v. 65, p. 661, 1950.

И. А. Тарханова.