ГЛИКОПРОТЕИДЫ

ГЛИКОПРОТЕИДЫ (гликопротеины) — биополимеры, состоящие из ковалентно связанных между собой пептидного (белкового) и углеводного компонентов. В тех случаях, когда углеводная часть молекулы Г. состоит из глюкозного остатка или остатков, Г. носят название глюко-протеидов. Г. обнаружены в организме животных, бактерий и растений и составляют наиболее обширный и хорошо изученный класс углеводсодержащих соединений. Г. входят в состав клеточной оболочки, циркулируют в кровяном русле в качестве транспортных молекул — напр, трансферрин, церулоплазмин (см. Кровь). К гликопротеидам относятся некоторые гормоны, ферменты, а также иммуноглобулины. Одно из первых предположений, для чего нужен углеводный компонент белкам, было сделано Эйларом (E. H. Eylar, 1965). При рассмотрении довольно большого количества Г. он обнаружил, что все они находятся вне клетки, в кровяном русле, слюне, молоке и других секретах. На основании этого факта им была предположена гипотеза, согласно к-рой углеводный компонент является своего рода пропуском, после получения к-рого белковая молекула должна обязательно покинуть клетку. В дальнейшем, однако, были получены данные, свидетельствующие о том, что многие внутриклеточные белки являются Г. и входят в состав различных внутриклеточных мембран и цитоплазматической мембраны. Кроме того, в различных секретах и сыворотке крови были обнаружены негликозилированные белки (альбумин, a-лактальбумин, химотрипсиноген и др.). Т. о., гипотеза Эйлара не может претендовать на универсальное разрешение вопроса о роли углеводного компонента. В дальнейших исследованиях было обнаружено, что если от углеводной части ряда сывороточных Г. (церулоплазмин, гаптоглобин, фетуин, орозомукоид) отщепить ферментативно сиаловую к-ту, то время полураспада этих асиало-гликопротеидов сократится от нескольких десятков часов до нескольких минут. При этом все указанные асиало-гликопротеиды связываются с мембранами паренхиматозных клеток печени.

Ряд гликопротеидов - гормонов (напр., гонадотропный и фолликулостимулирующий гормоны) после удаления сиаловых к-т очень быстро исчезает из кровотока и, как и сывороточные Г., оказывается в печеночных клетках. В результате гормон не связывается с клетками-мишенями и его биол, действие резко снижается.

Сиаловая кислота (см.) может, по-видимому, определять время жизни в кровотоке не только молекул Г., но и некоторых клеток, в частности эритроцитов. Ее отщепление от мембраны эритроцитов приводит к их быстрому исчезновению из кровотока.

Кроме выполнения информативной функции (куда направляться молекулам или клеткам), углеводные цепи Г. повышают стабильность молекул, в состав которых они входят, и предохраняют их от действия протеолитических ферментов. Многие гликопротеиды-ферменты, в частности лизосомные гликозид азы, обладают удивительной стабильностью, сохраняя полностью свою активность в гомогенатах при t° 37° в течение нескольких десятков часов. В модельных опытах было установлено, что после присоединения углеводной части к нек-рым ферментам — альфа- и бета-амилазам, к трипсину, а также к нек-рым белкам (конканавалин А) в значительной степени повышается их термостабильность и устойчивость к протеолизу.

Недавно обнаружено еще одно свойство Г. Оказалось, что в крови и тканях антарктических рыб находятся гликопротеиды-антифризы, препятствующие образованию кристаллов льда в организме рыб при t° ниже 0°.

Г., содержащиеся в различных слизях внутренних и наружных поверхностей животного организма, выполняют защитную роль при действии различных факторов внутренней и окружающей среды и участвуют в защите организма от проникновения бактерий.

Роль Г. в межклеточных взаимодействиях является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений в их исследовании. Входя в состав клеточной оболочки, Г. играют важную роль в ионном обмене клетки," иммунологических реакциях, дифференцировке тканей, явлениях межклеточной адгезии и т. д.

Размер молекул Г. и соотношение углеводного и белкового компонентов варьируют в широких пределах. Известны Г. с мол. весом от 15 000 (рибонуклеаза В) и до 1 000 000 и выше (Г. из слюны человека и животных). Углеводный компонент может составлять от 1—3% (овальбумин, различные коллагены) до 80— 90% (групповые вещества крови) всей молекулы Г.

Число углеводных цепей, присоединенных к пептидному «стержню» Г., может быть весьма различным. В некоторых Г. (рибонуклеаза В., трансферрин, кислый альфа1-гликопротеид) число углеводных цепей не превышает 1—4, в других типах Г. (групповые вещества крови, некоторые муцины из подчелюстных желез) число углеводных цепей достигает 300—800. Следует отметить высокую гетерогенность углеводного компонента Г. Даже в разных молекулах Г. одного типа, выделенных из одного и того же источника, наблюдаются различия в числе и природе углеводных звеньев в цепи и самих цепей, а также в типе гликозидной связи между углеводными остатками. Г. отличаются большим разнообразием форм своих молекул: от глобулярных (овальбумин) до сильно вытянутых, характерных, напр., для Г. из подчелюстных желез человека и животных.

Моносахаридными компонентами Г. являются аминосахара (см.) — N-ацетилглюкозамин и N-ацетил галактозамин, в которых аминогруппа при втором углеродном атоме обычно ацетилирована. В состав Г. входят представители дезоксисахаров — L-фукоза и L-рамноза. Типичным компонентом Г. является нейраминовая (сиаловая) к-та.

Пептидная часть Г. характеризуется определенными особенностями, установление которых позволило внести ясность в классификацию Г. и подразделить их на группы на основе типов углевод-пептидных связей.

Примером таких связей может служить гликозид амидный тип связи между N-ацетилглюкозамином и бета-амидным азотом аспарагина (см.). Эта связь относительно устойчива к действию к-т и щелочей и часто встречается в Г. плазмы крови, иммуноглобулинах, гликопротеидах-ферментах, гликопротеидах-гормонах. Пептидная часть Г. с гликозиламидным типом связи характеризуется обычным аминокислотным составом, типичным для большинства белков.

О-Гликозидный тип связи отмечается при связывании гликозидной части с треонином (см.). Сахаром, участвующим в образовании этого типа связи, может быть либо N-ацетил галактозамин (муцины, групповые вещества крови), либо галактоза (напр., Г. кутикулы земляного червя). Пептидная часть Г., характеризующаяся этим типом связи, отличается высоким содержанием серина и треонина, составляющих иногда (в групповых веществах крови) ок. 50% всех аминокислот. В гликопротеидах этой группы содержится также значительное количество пролина (от 11 до 20%).

О-Гликозидный тип связи с оксилизином или оксипролином подразделяется на два вида. Галактозил-оксилизиновая связь характерна для коллагена. Второй вид связи — арабинозил-оксипролиновая связь имеется в Г. высших растений.

Биосинтез углеводных цепей Г. является не матричным, а осуществляется при помощи нескольких гликозилтрансфераз, специфичных как в отношении доноров гликозильных остатков, так и в отношении их акцепторов. В качестве доноров гликозильных остатков обычно выступают нуклеозидфосфатсахара и так наз. липидные переносчики, о которых стало известно лишь в начале 70-х гг. 20 в. Липофильная часть молекул этих соединений представляет собой полинепредельный спирт, построенный из остатков изопрена, к к-рому через один (полипренолмо-нофосфатсахара) или два (полипренолипирофосфатсахара) остатка фосфорной к-ты присоединен углеводный остаток.

Инициация биосинтеза углеводных цепей Г. начинается после биосинтеза на рибосомах полипептидной цепи при помощи различных гликозилтрансфераз, катализирующих перенос первого моносахаридного остатка от указанных выше доноров. Это и определяет тип углевод-пептидной связи. Дальнейшее присоединение углеводных остатков, т. е. удлинение цепи — элонгация, и последняя стадия — терминация также происходит при участии различных гликозилтрансфераз, осуществляющих последовательное добавление моносахаридных звеньев.

Гликозилтрансферазы образуют семейство, каждое из которых осуществляет перенос только одного типа моносахаридов. Так, обнаружены семейства фукозилтрансфераз, сиалилтрансфераз, галактозилтрансфераз и др. Каждый член такого семейства, присоединяя один и тот же моносахаридный остаток, может обладать совершенно различной специфичностью по отношению к мол. весу молекулы акцептора, ее конформации и другим свойствам, а также по отношению к природе концевого, непосредственно гликозилируемого остатка или даже моносахаридного остатка, присоединенного к концевому остатку. Гликозилтрансферазы одного семейства могут отличаться двумя особенностями: а) они могут нуждаться в специфических молекулах акцептора, б) при гликозилировании одной и той же акцепторной молекулы трансферазы могут присоединять моносахаридный остаток с образованием различных типов гликозидной связи, синтезируя тем самым различные конечные продукты биосинтетической реакции. Все члены одного семейства гликозилтрансфераз нуждаются в одних и тех же нуклеозиддифосфатсахарах в качестве доноров гликозильных остатков.

При участии в биосинтезе Г. липидных переносчиков реакции гликозилирования могут протекать на поверхности раздела между липидной и водной фазой биол, мембран. К акцепторным молекулам в этих случаях могут переноситься не только моносахаридные остатки, но и олигосахаридные цепи. Предполагается, что липидные переносчики участвуют в биосинтезе внутренних углеводных цепей Г., характеризующихся гликозид амидным типом углевод-пептидной связи.

Разнообразие Г. определяется типом тканей, в которых обычно активность членов одного семейства гликозилтрансфераз относительно высока, а других — снижена или полностью отсутствует. См. также Группы крови.

Биохимические методы определения гликопротеидов

В биол, жидкостях, крови и моче имеется смесь различных Г. Для выделения каждого из них в чистом виде требуется сложная методика, длительное время, что и затрудняет применение ее для серийных исследований. Поэтому в клин, практике наиболее распространено суммарное определение Г. по одному из входящих в них компонентов углеводной части — гексозам, гексозаминам, фукозе, сиаловым к-там или по способности давать реакцию йодная к-та — реактив Шиффа (см. Шиффа реактив).

Наиболее применяемые методы определения Г. можно условно разделить на две основные группы: химические и электрофоретические. Для специальных исследований применяются хроматографические, полярографические и радиоиммунологические методы.

Большинство хим. методов основано на определении углеводной части молекулы Г. с применением различных цветных реакций, основанных на взаимодействии моносахарида с серной к-той с образованием производного фурфурола (напр., реакции с орцином, антроном, триптофаном, карбозолом, дифениламином, резорцином, альфа-нафтолом). Такие реакции дают окрашенный продукт с одним из перечисленных соединений или ароматическим азотистым основанием. Количество образовавшегося окрашенного продукта определяют с помощью фотоэлектроколориметрирования. Наиболее точным считается метод определения гексоз, использующий цветную реакцию с орцином или резорцином; наиболее чувствительным — метод с применением альфа-нафтола, который, однако, чаще используется для ориентировочных исследований.

Почти все методы, применяемые для определения аминосахаридов, основаны на классическом методе Эльсона — Моргана (1933). Принцип метода заключается в том, что аминосахар реагирует с ацетил ацетоном в горячем слабощелочном р-ре. При этом образуется смесь пирролов, дающая красное окрашивание с реагентом пара-диметиламинобензальдегидом, интенсивность к-рого определяют фотометрически при 530 нм. Глюкозамин дает почти такое же окрашивание, как и галактозамин; с маннозамином окрашивание несколько слабее. Для построения калибровочной кривой в основном используют солянокислый глюкозамин.

Для определения фукозы применяется реакция, в к-рой к продукту взаимодействия Г. с серной к-той прибавляется солянокислый цистеин.

Эта реакция является основой почти всех методов, применяемых для определения метилпентоз (см. Дише метод).

Для обнаружения и количественного определения сиаловых к-т предложен ряд методов: орциновый метод с реактивом Биаля, резорциновый метод, метод с тиобарбитуровой к-той, дифениламиновая реакция и метод Гесса (см. Электрофорез).

Для выявления гликопротеидных фракций предложен ряд методов; окраска толуидиновым синим, коллоидным железом, анциановым голубым и др. Однако наиболее распространен метод окраски гликопротеидов реактивом Шиффа, в основу к-рого легла реакция (йодная к-та — фуксинсернистая к-та), первоначально предложенная Хочкиссом (R. D. Hotchkiss) и Мак-Манусом (J. F. A. McManus) для окрашивания Г. в гистол, срезах. Принцип этого метода состоит в том, что углеводные компоненты Г. окисляются р-ром йодной к-ты до альдегидов, а альдегиды выявляются с помощью реактива Шиффа. Для количественного определения окрашенные фракции элюируются с электрофореграмм с последующим фотометрированием элюатов или определяются с помощью денситометрии (см.).

У здорового человека, по данным различных авторов, относительное содержание фракций Г. (в %) следующее: альбуминовая — 10,4— 16,6; альфа₁-глобулиновая — 14,2—18,3; альфа₂-глобулиновая — 24,8—31,8; бета-глобулиновая — 21,7—25,0; углобулиновая — 16,0—19,2.

Наиболее высокий процент содержания углеводов отмечается в глобулиновых фракциях, в частности в альфа2- и бета-глобулинах (см. Глобулины).

Перспективным является метод иммуноэлектрофореза (см.), а также метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), разрешающая способность к-рого может в 10 раз превышать разрешающую способность электрофореза на бумаге.

Результаты определения гликопротеидов имеют важное дифференциально-диагностическое значение при заболеваниях соединительной ткани, сердечно-сосудистой системы, жел.-киш. тракта, печени, почек, легких. При этом изучение изменений в содержании этих веществ в сыворотке крови и других биол, жидкостях в дополнение к клин, данным имеет большое значение для оценки течения патол, процесса, эффективности лечения и для прогноза. При воспалительных процессах — остром ревматизме, туберкулезе, пневмонии, плеврите отмечается увеличение содержания в сыворотке крови всех фракций Г., особенно альфа₁- и альфа₂-глобулинов. Наибольшее значение имеет определение абсолютного и относительного содержания Г. в сыворотке крови при ревматизме. Концентрация Г. в сыворотке крови увеличивается также при гломерулонефрите, опухолях, некрозе, нередко при диабете.

Гистохимические методы определения гликопротеидов в тканях

Гистохим, методы обнаружения Г. основаны на выявлении их реакционноспособных групп, таких как 1,2-гликольные группы, а также карбоксильные группы сиаловых к-т. Для фиксации Г. можно использовать 10% р-р формалина при t° от 0 до 4° в течение 24—48 час. Существуют методы фиксации с добавлением в формалин некоторых солей, а также различных катионных детергентов (см.), способствующих лучшей сохранности полисахаридов и их последующей гистохим, дифференцировке. Предпочтение следует отдавать методу лиофильной сушки срезов с последующей заливкой в парафин. Существует значительное число гистохим, методов и их модификаций выявления полисахаридов, но далеко не все они в достаточной степени достоверны и доступны в практическом отношении. Наиболее достоверным при обязательном применении контрольных реакций и обоснованным с точки зрения химии является метод Мак-Мануса — Хочкисса—Шабадаша. В лабораториях нашей страны чаще всего применяется модификация Шабадаша. В основе метода лежит окисление 1,2-гликольных групп полисахаридов солью йодной к-ты с последующим выявлением полученных в результате реакции альдегидов фуксинсернистой к-той (реактивом Шиффа). В участках локализации муко- и гликопротеидов развивается фиолетово-красное окрашивание различной интенсивности. Кроме этих соединений, реакция выявляет также гликоген, гликолипиды и свободные альдегиды. Неспецифические альдегиды могут появиться также в результате окисления соединений с ненасыщенными связями во время фиксации материала формалином. Поэтому для получения достоверных результатов необходим тщательный гистохим, контроль: прежде всего нужно исключить наличие свободных и неспецифических альдегидов и, если они присутствуют, провести реакцию их блокирования. Применяя солодовую диастазу (в крайнем случае амилазу слюны), можно исключить наличие гликогена.

Необходимые реактивы: кристаллический основной фуксин (или так наз. основной фуксин для фуксинсернистой к-ты), 1 н. HCl, метабисульфит калия или натрия (K₂S₂O₅ или Na₂S₂O₅), перйодная к-та или лучше ее калиевая соль (KIO₄), высокоочищенная солодовая диастаза, солянокислый гидроксиламин. Для реакции ацетилирования: безводный пиридин и уксусный ангидрид, 0,1 н. едкого кали (KOH), препарат нейраминидазы. Липиды удаляют обработкой различными растворителями (напр., горячей смесью хлороформа и метилового спирта).

Ход определения. Серийные срезы, опытные и контрольные, подвергаются обработке р-ром перйодата калия, быстро промывают в дист, воде и помещают в реактив Шиффа, затем промывают в свежеприготовленном р-ре бисульфита (10 мл 10% р-ра метабисульфита калия, 10 мл 1 н. HCl и 200 мл дист. воды). Срезы тщательно отмывают в большом объеме воды, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в нейтральный канадский бальзам.

Реакция ацетилирования гликольных групп и применение нейраминидазы подтверждают достоверность полученных результатов.

Библиография Анасашвили А. Ц. Гликопротеиды сыворотки крови и мочи, М., 1968, библиогр.; Видерщайн Г. Я. Углеводсодержащие соединения, их биосинтез и роль в животной клетке, Мо лек. биол., т. 10, № 5, с. 957, 1976, библиогр.; Гликопротеины, под ред. А. Готтшалка, пер. с англ., т. 1 — 2, М., 1969; Д ере-вицкая В. А. Химия гликопротеинов, Усп. биол. хим. под ред. Б. Н. Степаненко, т. 8, с. 168, М., 1967; Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, под ред. В. В. Меньшикова, М., 1973; Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., с. 741 и др., М., 1962; Принципы и методы гисто-цитохимического анализа в патологии, под ред. А. П. Авцына и др., с. 7, Л., 1971; Spiro R. G. Glycoproteins, Advanc. Protein Chem., V. 27, p. 349, 1973, bibliogr.

Г. Я. Видершайн; А. Ц. Анасашвили (мет. иссл.), P. А. Симакова (гист.).