ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Успехи Генной инженерии связаны с разработкой техники объединения генетических структур из различных источников в одной молекуле ДНК. Решающим в конструировании гибридных молекул in vitro явилось использование эндонуклеаз рестрикции — особых ферментов, способных разрезать молекулы ДНК в строго определенных участках. Такие ферменты обнаружены в клетках Escherichia coli, несущих плазмиды типа R, обусловливающие устойчивость бактерий к нек-рым лекарственным препаратам, в клетках Haemophilus influenzae, Serratia marcescens и других микроорганизмов. Один из наиболее часто используемых ферментов этого типа — эндонуклеаза рестрикции EcoRI, синтезируемая плазмидой RI в клетках E. coli. Фермент распознает участок ДНК с уникальной последовательностью из шести пар нуклеотидов и разрезает двунитчатую структуру ДНК на этом участке т. о., что с обеих сторон образуются однонитевые концы из четырех нуклеотидов (так наз. липкие концы). Поскольку фермент разрезает молекулы ДНК независимо от их происхождения строго определенным образом, все образовавшиеся в результате действия фермента фрагменты ДНК будут иметь одни и те же липкие концы. Комплементарные липкие концы любых фрагментов ДНК объединяются водородными связями, образуя гибридную кольцевую ДНК (рис.). Для стабилизации гибридной молекулы ДНК используют другой фермент — полинуклеотидлигазу, восстанавливающую ковалентные связи, разорванные ферментом рестрикции. Последовательность, специфично распознаваемая EcoRI, встречается в ДНК не чаще, чем через 4000—16 000 пар нуклеотидов. Следовательно, фрагмент ДНК, образовавшийся под действием EcoRI, может включать по крайней мере один неповрежденный ферментом ген (один ген в среднем содержит 1000—1500 пар нуклеотидов).

Применение эндонуклеаз рестрикции и ряда других ферментов дает возможность получать сложные рекомбинантные ДНК. Группа исследователей в США под руководством Берга (P. Berg) сумела объединить в составе одной молекулы ДНК генетическую информацию из трех источников: полный геном (см.) онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага λ и группу генов кишечной палочки, ответственных за усвоение галактозы. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку авторы этой работы остановились перед потенциальной опасностью распространения онкогенных вирусов животных в популяции бактерий, обитающих в кишечнике человека. Известно, что очищенная ДНК вирусов может проникать в различные клетки млекопитающих и стабильно наследоваться ими.

Впервые функционально активные молекулы гибридной ДНК удалось сконструировать в США Коэну (S. Cohen) с соавт. Группа Коэна последовательно решала проблему объединения и клонирования (избирательного накопления) молекул ДНК, выделенных из видов, все более удаленных друг от друга в филогенетическом отношении. Процедура клонирования обычно заключается в том, что ДНК из различных источников фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции, затем эти фрагменты объединяют in vitro в общую структуру и вводят в реципиентный организм, к-рым в опытах Коэна служит кишечная палочка. Установлено, что клетки нескольких видов бактерий (в т. ч. Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) могут быть трансформированы (см. Трансформация) с помощью рекомбинантных молекул ДНК. При этом плазмидная часть гибридной молекулы (либо одна из плазмид, если в составе гибридной молекулы объединены две плазмиды из различных источников) служит вектором, т. е. обеспечивает перенос в реципиентные клетки филогенетически чужеродного генетического материала и его размножение в них. Первой плазмидой, использованной Коэном с соавт, в качестве вектора, была полученная им in vitro плазмида pSC101, контролирующая устойчивость бактерий к тетрациклину. Эта небольшая плазмида состоит всего из 8000 пар нуклеотидов. Она атакуется ферментом EcoRI лишь в одном участке, причем фермент не повреждает способность плазмиды к последующей репликации в клетках E. coli и контролировать устойчивость к тетрациклину. Эти особенности позволили использовать ее для конструирования in vitro гибридных молекул ДНК. На первых этапах к pSC101 присоединили плазмидную ДНК, выделенную из различных видов бактерий, а затем и из высших организмов. Так были созданы «химерные» плазмиды (т. е. не способные возникать в природных условиях), объединившие в своем составе генетический материал кишечной палочки, участок ДНК из ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, контролирующий синтез рибосомных РНК, и участок ДНК морского ежа, контролирующий синтез белков- гистонов, либо ДНК митохондрий мыши. В клетках кишечной палочки, в которые вводили такие гибридные, «химерные», плазмиды, была зарегистрирована работа генов высших организмов.

В отличие от pSC101, присутствующей в клетке лишь в 4—6-й копиях, некоторые другие плазмиды, используемые в качестве векторов, в определенных условиях могут многократно реплицироваться, образовывая несколько тысяч копий в одной клетке. Такими свойствами обладает, напр., плазмида ColEI, контролирующая синтез колицина (см. Бактериоциногения). Подобно pSC101, ColEI разрезается ферментом EcoRl лишь в одном участке, а к образовавшейся линейной молекуле с липкими концами легко присоединяется чужеродная ДНК, также обработанная EcoRI. Т. о., к ColEI удалось «подшить» гены триптофанового оперона кишечной палочки. В клетках, несущих множество копий сконструированной гибридной плазмиды, резко увеличилась продукция белков-ферментов, контролируемых генами биосинтеза триптофана. В системе in vitro удалось присоединить плазмиду ColEI к нек-рым R-факторам и умеренному фагу. Подобные работы впервые выполнены в СССР под руководством академика А. А. Баева и профессора С. И. Алиханяна. Комбинированные векторные плазмиды, образованные ColEI и R-факторами, способны интенсивно размножаться в бактериальных клетках, подобно ColEI, и в то же время обусловливают устойчивость клеток к антибиотикам, что значительно упрощает отбор бактерий — носителей гибридных плазмид.

В качестве векторов используют и умеренные фаги. В системе in vitro сконструированы гибридные частицы бактериофага, включившие в свою структуру бактериальные гены, ДНК других фагов либо высших организмов (напр., ДНК плодовой мушки-дрозофилы).

Функциональную активность гибридных ДНК определяют возможностью их переноса в клетки реципиентных организмов и последующего умножения (амплификации) в этих клетках. В качестве реципиентов уже сейчас эффективно используют не только бактерии, о чем упоминалось выше, но и клетки высших организмов, пока, однако, лишь в виде культуры ткани, культивируемой вне организма. Имеются указания на возможность проникновения ДНК фагов, несущих бактериальные гены, в клетки соединительной ткани (фибробласты) человека, в протопласты либо в недифференцированную культуру (каллус) клеток растений. В 1971 г. амер. исследователь Меррил (С. R. Merril) с соавт, сообщил об опытах по исправлению наследственного дефекта — галактоземии (см.) путем введения в «больные» клетки галактозных генов бактерий, включенных в состав ДНК трансдуцирующего фага. В результате клетки больного галактоземией, дефектные по ферменту бета-D-галактозо-1-фосфатуридилтрансферазе, не способные усваивать галактозу, восстанавливали нормальную способность к росту в присутствии галактозы, а в их экстрактах была зарегистрирована ранее отсутствовавшая ферментативная активность. Сходный результат был получен Хорстом (J. Horst) с соавт, при введении бактериального гена, контролирующего синтез бета-галактозидазы в фибробласты больного с генерализованным ганглиозидозом, характеризующимся резкой недостаточностью этого фермента. Маньон (W. Munyon) и его сотр. с помощью вируса герпеса перенесли ген, контролирующий синтез тимидинкиназы, из клеток человека в клетки мыши, восстановив способность дефектных мышиных фибробластов синтезировать этот фермент.

Одним из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений является гибридизация соматических клеток, разработанная Эфрусси (В. Ephrussi) и Барски (G. Barski). Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых различных источников. Продемонстрирована возможность передачи отдельных генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, в которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Развитие методов микрохирургии клеток позволило пересаживать клеточные ядра из соматических клеток в оплодотворенные яйцеклетки и получать в результате абсолютно идентичные организмы. Гибридизация клеток дала возможность индуцировать синтез глобина человека в зародышевых клетках лягушки. Все эти примеры демонстрируют потенциальные возможности Г. и.

Практическое значение Г. и. для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов обмена у человека (см. окружающую среду (см.). Изучается возможность создания совершенно новых форм животных и растений за счет преодоления межвидовых барьеров скрещиваемости. Однако при оценке Г. и. как новой формы освоения живой природы следует учитывать не только ее возможную революционизирующую роль в биологии, медицине и сельском хозяйстве, но и возникающие в связи с ее развитием возможности появления новых форм патогенных микроорганизмов, опасность распространения в популяциях бактерий, обитающих у человека, гибридных ДНК, несущих Онкогенные вирусы, и т. д. Конечно, преднамеренное использование достижений науки, и в т. ч. Г. и., в антигуманных, человеконенавистнических целях возможно лишь в обществе, в к-ром благо человека приносится в жертву наживе и агрессии.

Из дополнительных материалов

Генетическая инженерия продолжает оставаться быстро прогрессирующим методом исследования в молекулярной биологии и генетике. Необходимо отметить, что понятия «генетическая инженерия» и «генная инженерия» не являются полными синонимами, т. к. исследования, относящиеся к генетической инженерии, не ограничиваются только манипуляциями с генами как таковыми. В настоящее время методы генетической инженерии позволяют проводить наиболее глубокий и детальный анализ природных нуклеиновых к-т — веществ, ответственных за хранение, передачу и реализацию генетической информации (см. Нуклеиновые кислоты.), а также создавать модифицированные или абсолютно новые, не встречающиеся в природе гены (см. Ген), комбинации генов и с высокой эффективностью экспрессировать их в живой клетке (см. Экспрессивность гена). Из конкретных практических достижений генетической инженерии в последнее десятилетие наиболее важным следует признать создание продуцентов биологически активных белков — инсулина (см.), интерферона (см.), гормона роста (см. Соматотропный гормон) и др., а также разработку генно-инженерных способов активизации тех звеньев обмена веществ, к-рые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных веществ. Таким путем получены продуценты нек-рых антибиотиков, аминокислот и витаминов, во много раз более эффективные, чем продуценты этих веществ, выведенные традиционными методами генетики и селекции. Разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования вакцинации вирусом осповакцины, в геном к-рого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (напр., вирусов гепатита или гриппа): в результате прививки сконструированным таким образом вирусом организм вырабатывает иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, белок к-рого кодируется встроенным геном.

Существенно выросла мировая коллекция рестрикционных эндонуклеаз — рестриктаз, основных «инструментов» генно-инженерных манипуляций. Выделено более 400 рестриктаз, «узнающих» ок. 100 различных по структуре специфических участков (сайтов) в молекулах ДНК (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты) и расщепляющих полинуклео-тидную цепь ДНК по этим участкам. С помощью одного такого фермента или комбинации нескольких рестриктаз можно выделить практически любой ген в составе одного или нескольких фрагментов ДНК (так наз. рестрикционных фрагментов). Это расширило возможности генетической инженерии не только в отношении выделения генов, но и в отношении активизации их работы, анализа структуры генов и их молекулярного окружения. Разработаны методы синтеза целых генов с заданной последовательностью нуклеотидов, появилась возможность снабжать синтезированные и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять единичные нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его нуклеотидную цепь с точностью до одного нуклеотида.

Достижением генетической инженерии явилось ее проникновение в организацию и функционирование механизмов наследственности клеток высших организмов, в т. ч. и человека. Именно на высших эукариотах с помощью методов генетической инженерии получены наиболее интересные данные. Успехи генетической инженерии во многом связаны с получением новых специализированных векторов, позволяющих эффективно клонировать (размножать) индивидуальные фрагменты ДНК (гены) и синтезировать белки, кодируемые этими генами.

Рестрикционные фрагменты, соединенные с ДНК-векторами, клонируют в живой клетке, используя способность таких векторов воспроизводиться (реплицироваться) в клетке во множестве копий. В зависимости от размеров фрагментов, подлежащих клонированию, и цели исследования используют векторы одного из четырех типов — Бактериофаг), космиды или производные фагов с однонитевой ДНК.

Для клонирования сравнительно небольших фрагментов ДНК (до 10 тыс. пар нуклеотидов) применяют плазмидные векторы (pBR322, рАТ 153, pUR250, pUC19 и др.). Достижением генетической инженерии последних лет было получение векторов на основе фага X (Харон 4А, gtwes-B), в к-ром часть генома замещена фрагментом чужеродной ДНК. Гибридный геном искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Образуя при размножении в клетке несколько тысяч копий, реконструированный фаг лизирует ее и выделяется в культуральную среду. С помощью таких векторов клонируют фрагменты ДНК длиной 10—25 тыс. пар нуклеотидов.

Космидные векторы (pIB8, MUA-3) представляют собой гибрид фага X и плазмиды. Они содержат так наз. COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий космидным векторам реплицироваться в бактериях так же, как это делают плазмиды. Таким образом, полученный рекомбинантный геном с высокой эффективностью заражает бактерии подобно бактериофагу, но размножается в них как плазмида, не вызывая гибели бактериальной клетки. Космиды применяют для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35—45 тыс. пар нуклеотидов.

Векторы, представляющие собой производные фагов с однонитевой ДНК (М13 mp8, М13, тр73 и др.), сконструированы на основе кольцевой молекулы ДНК бактериофага М13. Для встраивания чужеродной ДНК используют репликативную двуспиральную молекулу ДНК фага. Вектор, несущий чужеродную ДИК, вводят в бактериальные клетки, где рекомбинантные молекулы размножаются, не лизируя эту клетку, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусная частица с однонитевой молекулой ДНК. Эти векторы используют для клонирования фрагментов ДНК (до 300—400 пар нуклеотидов).

Ген, необходимый для генно-инженерных манипуляций, получают путем клонирования соответствующих рекомбинантных молекул ДНК и отбора таких клонов. В тех случаях, когда клонируют гены высших организмов и человека/ экспрессия к-рых в E. coli (чаще всего используемой для таких целей) невозможна, процедуру клонирования и отбора проводят в несколько этапов. На первом этапе создают так наз. библиотеку генов из фрагментов ДНК (клонированных непосредственно из генома клетки) или из клонированных ДНК-копий (кДНК) соответствующей матричной РНК. Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующих кДНК, получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней — о характере аномалий в генетическом материале, следствием к-рых и является это заболевание. Из библиотеки генов, пользуясь современными приемами, можно извлечь необходимый ген с окружающими его участками генома. В настоящее время созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Уже клонировано и в той или иной мере изучено несколько сот генов и других последовательностей нуклеотидов в ДНК человека.

Возможности генно-инженерных исследований не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо не только клонировать ген, но и обеспечить его экспрессию в клетке, т. е. реализовать заключенную в нем информацию в аминокислотную последовательность полипептидной цепи белка, кодируемого этим геном. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то бывает достаточно выделить ген с регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, напр., экспрессии эукариотического гена в клетках Е. coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена. Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы Ва131, к-рая обладает уникальным свойством гидролизовать обе цепи двуспиральной линейной молекулы ДНК начиная с конца молекулы, т. е. этот фермент удаляет с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» к-рых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи, затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область эукариотического гена с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов.

Успехи генетической инженерии тесно связаны с развитием и совершенствованием методов определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) в молекулах ДНК. Значительное число рестриктаз, имеющихся в распоряжении исследователей, позволяет с абсолютной специфичностью выделять определенные фрагменты ДНК, а разработка и совершенствование методов клонирования дает возможность получать фрагменты даже уникальных генов в количествах, необходимых для анализа. Методы секвенирова-ния ДНК оказались настолько эффективными, что часто через определение последовательности нуклеотидов ДНК получают данные о последовательности нуклеотидов в молекулах соответствующих РНК и о последовательности аминокислотных остатков в синтезирующейся молекуле белка. При обработке результатов секвенирования ДНК широко используют ЭВМ. Для более полной и быстрой интерпретации полученных экспериментальных данных создаются национальные и международные компьютерные «банки» нуклеотидных последовательностей. В настоящее время определены полные последовательности нуклеотидов геномов ряда бактериальных плазмид и вирусов, уже решается проблема определения полных нуклеотидных последовательностей сначала отдельных хромосом, а затем и всего генома высших организмов, в т. ч. и человека.

С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, что являлось причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так наз. б лот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают гидролизу рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза в агарозе или полиакриламидном геле. Разделенные фрагменты переносят («перепечатывают») на специально обработанную хроматографическую бумагу, нитроцеллюлозу или нейлоновый фильтр и снова подвергают электрофоретическому разделению. Вырезают места электрофореграмм, соответствующие отдельным фракциям и содержащие однотипные фрагменты ДНК; вырезанные участки электрофореграмм инкубируют с ранее клонированным геном или его частью либо с полученной путем хим. синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащими радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, к-рые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов. Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов.

Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при гидролизе этими ферментами молекула ДНК расщепляется на ряд фрагментов различной длины. Перестройка структуры ДНК, в результате к-рой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания», приводит к изменению набора этих фрагментов (так наз. рестрикционных фрагментов), т. е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов(ГВДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена.

Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ (см.) проводится в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке: выбирают фрагмент ДНК с неизвестной функцией, устанавливают сцепление этого фрагмента ДНК с другими областями генома и его связь с определенными признаками. Этот подход позволил разработать методы ранней диагностики и выявления носителей таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшенна, муковисцидоз, биохимическая природа наследственных дефектов при к-рых пока не известна. При генеалогическом методе установления закономерностей наследственной передачи хореи Гентингтона было показано, что выделенный из генома человека фрагмент ДНК G8 тесно сцеплен с геном, определяющим заболевание, и по форме ПДРФ фрагмента G8 в данной популяции можно диагностировать это заболевание и выявлять носителей дефектных генов.

На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение, если и не для массового генетического просеивания (скрининга) при диспансеризации населения, то, но крайней мере, для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.

Генетическая инженерия позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах нек-рых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами генетической инженерии проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена строго определенных аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.

В области сельского хозяйства от генетической инженерии ожидают большого вклада в селекцию новых высокоурожайных сортов растений, устойчивых к засухе, болезням и вредителям, а также в выведение новых высокопродуктивных пород с.-х. животных.

Как и любое достижение науки, успехи генетической инженерии могут быть использованы не только на благо, но и во вред человечеству. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения рекомбинантных ДНК не так велика, как представлялось ранее. Рекомбинантные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, к-рые обеспечивают активный обмен генетической информацией, это так наз. поток генов. Однако на пути проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. В настоящее время очевидно, что при работе с большинством рекомбинантных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, к-рые применяют, напр., микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы как биологической защиты, так и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды. Поэтому весьма жесткие первые варианты правил работы с рекомбинантными ДНК были переработаны и значительно смягчены. Что касается преднамеренного использования достижений генетической инженерии во вред человеку, то и ученые, и общественность должны активно бороться за то, чтобы эта опасность так и осталась возможной лишь теоретически.

См. также Биотехнология.

Библиография: Алиханян С. И. Успехи и перспективы генной инженерии, Генетика, т. 12, Jvft 7, с. 150, 1976, библиогр.; Алиханян С. И. и др. Получение функционирующих рекомбинантов (гибридных) молекул ДНК, in vitro, там же, т. И, № 11, с. 34, 1975, библиогр.; Баев А. А. Генетическая инженерия, Природа, №1, с. 8, 1976; Тихомирова Л. П. и др. Гибридные молекулы ДНК фага X и плазмиды ColEl, Докл. АН СССР, т. 223, №4, с. 995, 1975, библиогр.; Brown D. D. a. Stern R. Methods of gene isolation, Ann. Rev. Biochem., v. 43, p. 667, 1974, bibliogr.; Chang A. C. Y. a. o. Studies of mouse mitochondrial DNA in Escherichia coli, Cell, v. 6, p. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. Boyer H. W. DNA nucleotide sequence restricted by the R1 endonuclease, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 69, p. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA, ibid., v. 71, p. 3455, 1974; Morrow J. F. a. o. Replication and transcription of eukaryotic DNA in Escherichia coli, ibid., p. 1743; Temin H. M. a. Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus, Nature (Lond.), v. 226, p. 1211, 1970.

Биотехнология, под ред. А. А. Баева, М., 1984; Бочков Н. П., Захаров А. Ф. и Иванов В. И. Медицинская генетика, М., 1984; Маниатис Г., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, пер. с англ., М., 1984; Antоnarakis S. E. a. o. DNA polymorphism and molecular pathology of human globin gene clusters, Hum. Genet., v. 69, p. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliography of cloned human and other selected DNAs, Amer. J. hum. Genet., v. 37, p. 386, 1985; Вotstein D. a. o. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms, ibid., v. 32, p. 314, 1980; Gusella J. E. a. o. DNA markers for nervous system diseases, Science, v. 225, p. 1320, 1984; Motulsky A. G. Impact of genetic manipulation on society and medicine, ibid., v. 219, p. 135, 1983; White R. a. o. A closely linked genetic marker for cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, p. 382, 1985; Wo о S. L. C., Lidsky A. S. a. Guttler F. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by gene mapping, J. Amer. med. Ass., v. 251, p. 1998, 1984.

Л. С. Чернин, В. H. Калинин.