ГЕНЕТИКА СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Описание
ГЕНЕТИКА СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК (греч, genetikos относящийся к происхождению; soma, somatos тело) — область генетики, изучающая закономерности наследственности и изменчивости элементарнюй структурной и функциональной единицы многоклеточного организма — соматической клетки. Выделение Г. с. к. произошло в связи с разработкой в середине 50-х гг. 20 в. методов культивирования вне организма изолированных животных клеток. Г. с. к. развивалась под влиянием генетики одноклеточных организмов. Ее развитие позволило обойти такую трудность генетического анализа человека, как невозможность направленного скрещивания, дало возможность проводить изучение генетических событий, происходящих с низкой частотой. Методы исследования, применяемые в Г. с. к., имеют большое практическое значение. Они способствуют изучению патогенеза на клеточно-молекулярном уровне и используются при разработке на этой основе новых методов диагностики, лечения и профилактики болезней, возникновение которых непосредственно связано с патологией клетки (наследственные болезни обмена веществ, злокачественные опухоли, клеточная иммунопатология).
Клетки, поддерживаемые в культуре путем пассажей в размножающемся состоянии (клеточные линии), могут либо незначительно изменяться по сравнению с исходными (диплоидные линии), либо претерпевать более серьезные изменения (гетероплоидные линии). Диплоидные культуры клеток генетически и биохимически более стабильны, но пока длительно культивировать удается лишь диплоидные клетки соединительнотканного происхождения. Гетероплоидные линии генетически неоднородны, что проявляется не только в разнообразии хромосомных наборов составляющих их клеток, но и в вариабельности питательных потребностей, активности ферментов, лекарственной устойчивости и др. Это связано с непрерывным возникновением в таких клеточных популяциях вариантов по разным признакам.
Генетический анализ (см.) невозможен без изучения потомства индивидуальных клеток. В Г. с. к. эта задача решается путем клонирования клеточных культур — выращивания на твердом субстрате клона (генетически однородного потомства отдельной клетки) в виде клеточной колонии. Успех в культивировании изолированных клеток человека, особенно в клонировании, зависит от создания адекватных условий для их размножения, прежде всего от удовлетворения специфических питательных потребностей клеток. Эта проблема окончательно не решена; поиски ведутся по пути создания полностью синтетических питательных сред, учитывающих специфические потребности дифференцированных клеток разных тканей. Создание таких сред одновременно является необходимым условием для стабилизации гено- и фенотипа культивируемых клеточных линий.
Необходимое условие проведения генетического анализа на соматических клетках — маркирование клеток по признакам, контролируемым индивидуальными генами. Разработка этой проблемы пока далека от завершения. Она находится в полной зависимости от прогресса в биохимии соматических клеток и создания методов селекции мутантов. Существует два метода получения генетически маркированных клеток человека. Первый — эксплантация клеток от больных наследственными энзимопатиями. Описано несколько десятков наследственных дефектов обмена у человека, в основе которых лежат мутации, четко проявляющиеся на клеточном уровне в виде нарушения нормального синтеза специфического фермента. Примером таких маркеров в культивируемых клетках соединительной ткани является отсутствие активности галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы — Г1ФУТ или гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы — ГГФРТ (болезнь Леша—Найхана), недостаточность глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы — Г6ФД (при некоторых гемолитических анемиях). Маркерами часто служат и нормальные биохим. признаки: ферменты группы дегидрогеназ (Г6ФД, лактатдегидрогеназа — ЛДГ, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа — 6ФГД, малатдегидрогеназа — МДГ и др.), киназы (тимидинкиназа — ТК, фосфоглицераткиназа — ФГК и др.), трансферазы (ГГФРТ, Г1ФУТ и др.). Реже используют антигенные маркеры: антигены групп крови и антигены тканевой совместимости.
Второй метод — использование в качестве маркеров мутаций, возникающих спонтанно или индуцированно уже в культивируемых клетках. Такими маркерами могут быть: отсутствие роста на среде без отдельных аминокислот (см. Ауксотрофность), резистентность к хим. веществам (аналогам азотистых оснований или нуклеозидов, антибиотикам), физ. факторам (ультрафиолетовому или ионизирующему излучению, температуре), вирусам. Особенно удобно выделение клонов соматических клеток — ауксотрофов, которые не могут размножаться на среде, не содержащей тех или иных питательных веществ. Один из предложенных способов их выделения состоит в следующем. Клетки выращивают на полноценной питательной среде, обеспечивающей выживание редких ауксотрофных мутантов; затем смешанную клеточную культуру переносят на минимальную среду с 5-бромдезоксиуридином (БДУ), где размножаются только прототрофы, способные синтезировать необходимые для роста вещества. БДУ является аналогом азотистого основания тимина и поэтому активно включается в ДНК растущих клеток. В ДНК клеток-ауксотрофов (их рост из-за отсутствия в среде необходимой аминокислоты ингибирован) включения БДУ не происходит. Т. о., ДНК клеток, растущих на минимальной среде, содержит БДУ, а ДНК клеток, не растущих на этой среде, лишена его. В свою очередь присутствие БДУ в клетках повышает их чувствительность к летальному воздействию УФ-лучей. Последующее ультрафиолетовое облучение уничтожает сенсибилизированные БДУ прототрофы. При посеве облученного клеточного материала на полноценную селективную среду вырастают только колонии адекватного среде ауксотрофного мутанта (рис. 1). Этим способом в культурах клеток китайского хомячка получены стабильные ауксотрофы, неспособные к синтезу глицина (гли-), гипоксантина (тип) и других метаболитов. Изучение спонтанного и индуцированного мутационного процесса на культивируемых клетках составляет самостоятельный раздел Г. с. к. и проводится на генном и особенно широко на хромосомном уровнях.
Необходимое условие проведения гибридологического анализа соматических клеток — обмен наследственными факторами и их рекомбинация у потомков. Нек-рым эквивалентом этих процессов в Г. с. к. служит феномен гибридизации соматических клеток с последующей сегрегацией хромосом одного из родителей. Сущность гибридизации соматических клеток состоит в образовании из двух клеток одной гибридной клетки (ГК) путем слияния. Такая клетка вначале имеет два самостоятельных ядра (гетерокарион). В случае их объединения создаются предпосылки для последующего размножения гибридных клеток [Барски, Эфрусси (G. Barski, В. Ephrussi)]. Частота спонтанного образования ГК чрезвычайно низка (одна ГК на десятки тысяч родительских), и совсем незначительны шансы на селективное вытеснение ими родительских форм из смешанной клеточной популяции. С помощью инактивированного парагриппозного вируса Сендай удается повысить частоту слияния клеток до 5—10%. Освобождение культур ГК от родительских форм осуществляется с помощью селективных питательных сред. Широко используется предложенная . с этой целью Литтлфилдом (J. W. Littlefield) среда Г АТ, включающая гипоксантин, аметоптерин и тимидин. Для гибридизации берут клетки, одни из которых в среде с аметоптерином не способны расти из-за отсутствия фермента тимидинкиназы (ТК-), другие — фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ-), обеспечивающих усвоение присутствующего в среде тимидина и гипоксантина соответственно. Аметоптерин необходим для блокирования синтеза производных этих веществ. Гибридные клетки типа (ТК+ГГФРТ-) X (ТК-ГГФРТ+) благодаря взаимному дополнению (комплементации) нормальными аллелями мутировавших генов будут расти на такой среде (рис. 2). Возможно применение полуселективных сред, когда мутацию несут клетки лишь одного из родителей, а клетки второго родителя либо высеяны в малом числе, либо медленно размножаются, либо не растут в монослое (культуры лимфоцитов крови). С помощью указанных методических приемов можно получить гибриды клеток различных тканей одного вида животных (внутривидовые) или разных видов, включая виды, относящиеся к далеко отстоящим друг от друга таксономическим группам (межвидовые), напр, гибриды клеток человек — мышь, человек — китайский хомячок, человек — комар. В гибридных клетках родительские геномы объединяются в единый интегральный геном. При этом отдельные признаки исходных клеток могут исчезать, могут также появляться новые признаки, что связывают с изменением активности соответствующих генов. При этом большинство родительских генов остается функционирующими без изменений. В межвидовых гибридах благодаря различиям в физ.-хим. свойствах (напр., электрофоретической подвижности) удается разделять гомологичные биохим, маркеры родителей (ферменты). Это одна из причин использования именно межвидовых гибридов для генетического картирования хромосом. Установлена возможность образования в ГК гетерополимерных молекул ферментов, когда субъединицы молекулы кодируются генами обеих родительских форм. Сегрегация генов, влекущая за собой их перекомбинацию, обеспечивается в ГК спонтанной и постепенной элиминацией хромосом одной из родительских форм. Так, в гибридных системах человек — мышь или человек — китайский хомячок утрачиваются хромосомы человека. Это вторая причина использования межвидовых гибридов для генетического картирования хромосом.
Гибридизация соматических клеток используется для разных видов генетических исследований. Широко развивается собственно генетический анализ (изучение групп сцепления генов и генетическое картирование хромосом человека), для чего применяют межвидовые гибриды. Картирование хромосом проводится путем сопоставления проявления в ГК биохим, маркеров и присутствия хромосом человека. Поскольку по мере размножения ГК хромосомы человека элиминируют, одновременное и воспроизводимое в повторных опытах сохранение или утрата двух или более маркеров в геноме ГК будет указывать на их сцепление. Если такое проявление маркеров коррелируется с поведением определенной хромосомы, появляется возможность «привязки» генов к данной хромосоме. Задача облегчается тем, что проблема идентификации хромосом человека и используемых для гибридизации лабораторных животных сейчас решена. На основе метода гибридизации соматических клеток и ряда других методов начато генетическое картирование хромосом человека. Получены сведения о локализации тех или иных генов во всех хромосомах одного человека, в частности о локализации более 20 генов в аутосоме одного человека, среди которых гены, контролирующие синтез ферментов 6ФГД, ФГМ (фосфоглюкомутазы), пептидазы С, о сцеплении генов, контролирующих синтез ферментов Г6ФД, ГГФРТ, ФГК и альфа-галактозидазы и их локализации в X-хромосоме.
Метод внутривидовой гибридизации ауксотрофных мутантов позволяет проводить анализ межгенной и внутригенной (межаллельной) комплементации (см. Мутационный анализ) у человека. Для этого используют клетки от разных доноров с одинаковым мутантным фенотипом. Если мутация затрагивает одни и те же локусы, комплементации нет, ГК на селективной среде не пролиферируют. Размножение гибридов свидетельствует о наличии межаллельной комплементации, т. е. о том, что контроль данного признака осуществляется более чем одной аллелью. С помощью такого анализа было показано существование межаллельной комплементации при галактоземии, которая характеризуется отсутствием активности Г1ФУТ. Это говорит о полиаллельности кодирующего данный фермент гена.
На системе гибридов между генетически репрессированным клеточным геномом (куриный эритроцит) и активно функционирующим геномом (клетки линии Hela человека и L мыши) доказана обратимость инактивации генов в высокодифференцированных клетках и исследуется цепь событий при дерепрессии генома [Харрис (Н. Harris)]. Гибридизация нормальных и опухолевых клеток позволяет оценить роль мутационных изменений генетического аппарата и изменений, связанных с состоянием генетической активности в малигнизации клетки.
Достижения Г. с. к. начинают внедряться в медико-генетическую практику. Диагностику наследственных дефектов обмена веществ и изучение их патогенеза все больше переносят на клеточный уровень, т. к. такая диагностика обеспечивает анализ не просто патол, метаболитов, а дефектных ферментов, лежащих в основе их возникновения. Такой подход позволяет более углубленно решать ряд практических задач диагностики, профилактики и лечения наследственных энзимопатий (расширение круга диагностируемых болезней, точность дифференциальной диагностики, возможность пренатальной диагностики и др.). При помощи комплементационного анализа возможно изучение генетической гетерогенности ряда наследственных болезней; в частности, уже показана генетическая неоднородность некоторых мукополисахаридозов и болезни Леша—Hайхана. Использование клеточных линий от больных с наследственными дефектами обмена позволяет перейти к проверке приемов специфической терапии. Так, из мочи и крови здоровых людей выделены специфические факторы, по-видимому ферменты, исправляющие ненормальный биохим, фенотип культивируемых клеток больных нек-рыми мукополисахаридозами.
Исследования по Г. с. к. пока проводятся лишь в немногих учреждениях СССР, США, Англии, Швеции, Франции и др. Специализированных самостоятельных учреждений по этой отрасли науки пока не существует. Единичны специализированные периодические и справочные издания, руководства и монографии.
См. также Хромосомы.
Библиография: Вахтин Ю. Б. Генетика соматических клеток, Л., 1974; Захаров А. Ф. Методические проблемы развития генетики соматических клеток млекопитающих и человека, Вестн. АМН СССР, № 9, с. 78, 1966; Синискалько М. Гибриды соматических клеток, Онтогенез, т. 2, № 2, с. 115, 1971, библиогр.; Шапиро Н. И. Актуальные проблемы генетики соматических клеток, Генетика, т. 11, № 6, с. 159, 1975; Эфрусси Б., Гибридизация соматических клеток, пер. с англ., М., 1976; Harris Н. Cell fusion, the Dunham lectures, Oxford, 1970; Harris M. Cell culture and somatic variation, N. Y., 1969; Human gene mapping 2, Rotterdam conference (1974), Cytogenet. cell Genet., v. 14, № 3—6, 1975, bibliogr.; Krooth R. S. a. Sell E. K. The action of Mendelian genes in human diploid cell strains, J. cell. Physiol., v. 76, p. 311, 1970; Puck T. T. Some considerations on genetic analysis at the single gene level in man, Ann. N.Y., Acad. Sci., v. 171, p. 406, 1970.
А. Ф. Захаров.