ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ

Протеолитическая активность микроорганизмов повышается при наличии в среде следов усвояемого азота (для чего достаточно добавить немного пептона), а также ионов некоторых металлов (напр., кальция и магния). Наличие же в средах углеводов (особенно глюкозы) или глицерина подавляет протеолитическую активность. Чаще всего протеолитическую активность определяют, выращивая микробов на желатине, реже на молоке, свернутой сыворотке, курином белке и т. д. При использовании желатины посев производят уколом в столбик, засеянные пробирки инкубируют при t° 20°. Результаты учитывают в 1-й, 10-й и 20-й день, отмечая степень и характер разжижения желатины (цветн. рис. 1 — 6). Если изучаемый микроб не растет при t° 20% то его можно выращивать при оптимальной для него температуре, но если она выше 25° (температура разжижения желатины), то для учета результатов пробирку с посевом охлаждают в холодильнике и сравнивают с контрольной незасеянной (см. Желатина). Свернутую сыворотку для определения протеолитической активности разливают в чашки Петри. Появление углублений и зоны разжижения вокруг колоний свидетельствует о протеолизе (цветн. рис. 7).

Протеолитическая способность испытуемой культуры может быть установлена путем посева ее на молочный агар, который готовят следующим образом: к 10 мл расплавленного агара добавляют 2 мл стерильного снятого молока, смешивают и дают застыть в чашке Петри. После посева чашку помещают в термостат. Если бактерии протеолитически активны, то казеин молока пептонизируется, и вокруг колоний образуются светлые зоны на мутном фоне среды.

Среды для определения гемолитических свойств

Некоторые микробы в процессе жизнедеятельности вырабатывают и выделяют в окружаю щую среду гемолизин, способный растворять (лизировать) эритроциты. Для обнаружения гемолитической способности культуру засевают на среды, содержащие кровь, — кровяной агар, реже бульон (цветн. рис. 8).

Различают альфа-гемолиз и бета-гемолиз. Если вокруг колоний на кровяном агаре образуются зоны, окрашенные в зеленый цвет, то это альфа-гемолиз, напр, у зеленящего стрептококка. Если же зоны, образующиеся вокруг колоний, прозрачны, то это бета-гемолиз, напр, у гемолитического стрептококка.

Среды для определения декарбоксилаз аминокислот

Для определения лизин-декарбоксилазы используют среду следующего состава: гидро лизата казеина 0,5%, дрожжевого экстракта 0,3%, глюкозы 0,1%, 1-лизина 0,5%, бромтимолового синего (спиртового р-ра) 4,5 мл, дист, воды до 100 мл, pH среды 6,0.

Для определения глутаминдекарбоксилазы: гидролизата казеина 0,5%, дрожжевого экстракта 0,3%, глюкозы 0,05%, l-глутаминовой к-ты (хлоргидрата) 0,5%, бромкрезолового синего (водного р-ра) 2,25 мл, дист, воды до 100 мл; pH среды 3,8. Среды, разлитые в пробирки по 3 мл, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или при 0,5 атм в течение 15 мин. При наличии у исследуемой культуры бактерий фермента, расщепляющего аминокислоту, продукты расщепления изменяют pH среды, соответственно изменяется цвет среды за счет индикатора.

Среда для определения цистиназы (проба Пизу). Агаровую среду, содержащую цистин и уксуснокислый свинец, засевают уколом и выдерживают 20—24 часа в термостате. При наличии у микроба фермента, расщепляющего цистин, среда чернеет по ходу укола и на глубине примерно 1 см от поверхности в среде появляется коричневое «облачко».

Среды для определения уреазы. Наряду с белками и аминокислотами для некоторых бактерий источником азота является мочевина, расщепляемая с помощью уреазы. Для выявления уреазной активности применяют бульон с мочевиной: на 100 мл бульона (pH 7,0) 1 г мочевины и 0,2 мл крезолового красного (спиртовой р-р). Разливают по 2—3 мл в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром 10 мин. Через 20—24 часа при наличии уреазы среда краснеет.

Среды для определения способности к расщеплению углеводов

Подавляющее большинство патогенных и условно патогенных для человека микроорганизмов обладает ферментами, вызывающими расщепление углеводов. Различия в наборе таких ферментов у микробов, принадлежащих к разным классификационным группам, используют в дифференциально-диагностических целях. Для этого в состав питательной среды вводят один или несколько углеводов (табл. 1).

Таблица 1. Углеводы, наиболее часто применяемые для идентификации микробов

При расщеплении углеводов, входящих в состав среды, образуются вторичные продукты (к-ты, альдегиды, газы), изменяющие реакцию среды (pH), что регистрируют при помощи индикаторов, вводимых в состав сред, меняющих окраску в зависимости от pH. Напр., розоловая к-та в кислой среде до pH 6,2—6,5 имеет желтую окраску, а начиная от pH 6,5 приобретает бледно-розовый цвет, переходящий в интенсивно-розовый при щелочной реакции (начиная от pH 7,2).

Наиболее широко распространены индикаторы Кларка и Лебса (табл. 2), которые по-разному окрашены в кислой и щелочной среде, имеют хорошо выраженные переходные тона и широкий диапазон чувствительности. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции; вне этой реакции они бесцветны. Таковы, напр., фенолфталеин, кислый фуксин и Андраде индикатор (см.).

Tаблица 2. ЦВЕТ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ИНДИКАТОРОВ КЛАРКА И ЛЕБСА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПОКАЗАТЕЛЯХ pH

В Д.-д. с. применяют также комбинированные индикаторы; они удобны в тех случаях, когда оттенки перехода от одного цвета к другому при изменении pH в определенных границах у одного индикатора недостаточно отчетливы. К таким индикаторам относятся В P — смесь водного голубого и розоловой к-ты, смесь р-ра Андраде и тимолового синего и др. (см. Индикаторы).

В границах рода, вида, разновидности у микробов отмечается не только разная способность к ферментации того или иного углевода, но и разный характер расщепления (с образованием газа или без него). Эти свойства широко используют для идентификации исследуемых микробов, применяя так наз. пестрый ряд, состоящий из сред Гисса с разными углеводами (см. Гисса среды). Применяют как жидкие среды Гисса (цветн. рис. 9— 11) с поплавком на дне пробирки для улавливания газа, так и полужидкие (цветн. рис. 12—14), где образование пузырьков газа регистрируется разрывами столбика среды по ходу укола.

Наряду с жидкими и полужидкими средами применяют плотные (агаровые) питательные среды: колонии бактерий, расщепляющих углевод, введенный в среду, приобретают ту или иную окраску, в зависимости от добавленного к среде индикатора. Примером могут служить Дригальского-Конради среда (см.) и др.

Комбинированные среды

Большое распространение в микробиол. практике получили комбинированные Д.-д. с., позволяющие одновременно определять несколько биохим, признаков микробной культуры. Среда Расселла дает возможность определить сбраживание сразу двух углеводов — лактозы и глюкозы (см. Расселла среда).

Комбинированная среда с мочевиной и углеводами позволяет в одной пробирке дифференцировать микроорганизмы по пяти свойствам и уже на 2-е сут. исследования исключить большую группу непатогенных энтеробактерий. К сброженному казеиновому перевару, разведенному до содержания общего азота не более 90—100 мг%, прибавляют 1% агар-агара. Растопленный агар доводят до кипения, фильтруют и устанавливают pH 7,2. Затем прибавляют предварительно растворенные в кипящей дист, воде 1% лактозы, 0,1% глюкозы и 1% мочевины. Индикатора (0,4 тимолового синего в 100 мл индикатора Андраде) добавляют 4%. Среду разливают по 6 мл в стерильные пробирки, стерилизуют один раз текучим паром 15 мин., скашивают так, чтобы остался столбик. Как и в среде Расселла, расщепление глюкозы сопровождается покраснением только столбика, расщепление лактозы — покраснением всей среды. При разложении мочевины реакция среды становится резко щелочной, и среда приобретает фиолетовый цвет, переходящий при слабом расщеплении в зеленоватый, при сильном — в синий. Образование газа определяют в столбике агара. Применяя соответствующие бумажки, пропитанные реактивами, определяют образование индола и сероводорода.

Трехсахарный агар с мочевиной для энтеробактерий. К 100 мл питательного агара pH 7,2—7,4 прибавляют 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита и 0,4 мл фенолового красного (0,4% р-р).

Среду разливают по пробиркам, стерилизуют при t° 110° в течение 20 мин. и скашивают.

Среда Клиглера. К 1 л 1,5—1,7% мясопептонного агара добавляют 10 г лактозы, 10 г сахарозы и 1 г глюкозы. После растворения углеводов добавляют по 10 мл 2% р-ра сернокислого железа, 0,8% р-ра тиосульфата натрия (Na2S2O3-7Н2O) и 0,4% р-ра сульфита натрия (Na2SO3). Эта смесь солей служит реактивом на сероводород. Добавляют также 24 мл 1% водно-спиртового р-ра фенолового красного. Устанавливают pH 7,4, среду разливают в пробирки и после стерилизации (1 раз текучим паром) скашивают.

Ряд Д.-д. с. выпускают сухими: Эндо, Левина, Бучина (для коринебактерий), среды с углеводами и индикатором ВР и др. Это устраняет неудобства, связанные со сложностью приготовления питательных сред, придает им стандартность. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде в концентрациях 1,5—6%.

Из сухих сред с углеводами могут быть приготовлены некоторые из упомянутых выше комбинированных сред: среда Расселла, «скошенный столбик», трехсахарный агар с мочевиной и среды по оригинальным прописям. Напр., комбинированная среда из сухих питательных сред, для коринебактерий: в 100 мл дист, воды растворяют при нагревании 4 г сухой среды с сахарозой, 0,1 г химически чистой глюкозы и 1 з мочевины; разливают по пробиркам, стерилизуют текучим паром 30 мин. и скашивают, как среду Расселла. Дифтерийная палочка расщепляет только глюкозу (синяя окраска столбика). Дифтероиды, ферментируя глюкозу и сахарозу, окрашивают и косяк, и столбик. Ложнодифтерийная палочка разлагает мочевину — вся среда приобретает оранжевый цвет.

Лакмусовое молоко. В предварительно освобожденном от сливок молоке проверяют и устанавливают реакцию — она должна быть слабощелочной (pH 7,2). К молоку прибавляют 5—10% лакмусовой настойки и столько же 10% р-ра углекислой соды, чтобы пена молока приняла синевато-фиолетовый оттенок. Разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин. Незасеянная среда — фиолетового цвета, при отсутствии ферментации она не изменяется (цветн. рис. 23 — 27). Подкисление или подщелачивание среды вызывает в ней характерные изменения. На этой же среде можно определить редукцию лакмуса. Под влиянием к-ты, а в других случаях в результате действия сычужного фермента некоторых бактерий происходит свертывание казеина. Иногда используют также искусственную лакмусовую сыворотку по Зейтцу (цветн. рис. 15—17).

Фогеса—Проскауэра реакции (см.) — образование ацетилметилкарбинола.

Крахмальный агар. К 100 мл расплавленного питательного агара прибавляют 0,2 г растворимого крахмала, вскипяченного в 5 мл дист. воды. Среду разливают по чашкам, дают остыть и подсушивают. Растворимый крахмал получают путем обработки обычного крахмала 1 — 2% р-ром соляной к-ты при t° 53° в течение 18—20 час. При посеве на крахмальный агар быстро растущих микробов их достаточно инкубировать при t° 37° в течение 20—24 час. При медленном росте посевы инкубируют до 7 сут. Для обнаружения амилолитической активности исследуемых микроорганизмов чашки, извлеченные из термостата, заливают насыщенным и профильтрованным р-ром йода в 50% спирте так, чтобы покрылась вся поверхность агара. Когда среда окрасится в сине-фиолетовый цвет, жидкость сливают, а чашку рассматривают в проходящем свете. При наличии у бактерий амилазы вокруг колоний появляются светлые зоны.

Среды для определения окислительной или восстановительной активности микробов

Редуцирующая (восстановительная) активность микробов устанавливается по их способности обесцвечивать органические .красители, переводя их в бесцветные основания — лейкобазы, которые при обильном доступе кислорода вновь приобретают свой цвет. Восстановительная активность неодинакова у различных бактерий и поэтому используется как дифференциальный признак. Для определения редуцирующего действия микроорганизмов используют среды, содержащие органические красители: к 5 мл среды добавляют или метиленовый синий (1% водный р-р) — 1 каплю (цветн. рис. 18—19), или лакмусовую настойку — 1 каплю, или янусовый зеленый (0,5% водный р-р) — 0,1 мл, или индигокармин (5% водный р-р) — 1 каплю. Редукцию красителя регистрируют через 24 часа выращивания при t° 37°; при положительной реакции среда полностью обесцвечивается.

Не все красители пригодны для пробы на способность к восстановлению. Некоторые из них являются ингибиторами роста микробов, напр, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый и др.

Недостаток определения в жидких средах — контакт с кислородом воздуха, парализующий редукцию в результате окисления. Чтобы этого избежать, применяют агаровые среды, в которые испытуемый микроб засевают уколом. По ходу укола, и особенно в глубине агара, наблюдают постепенное обесцвечивание среды. В этих целях используются Омелянского среда (см.).

Среды с нитратами. Редуцирующей способностью микроорганизмы обладают также и по отношению к нитратам (солям азотной к-ты), которые они переводят в нитриты (соли азотистой к-ты). Процесс восстановления, называемый денитрификацией, идет дальше — до образования аммиака и свободного азота. Выявление у бактерий способности редуцировать нитраты проводят в питательных средах после тщательного контроля на отсутствие в них следов нитритов. Крайне важно поэтому при изготовлении сред использовать хим. чистые реактивы и хим. чистую посуду. Для определения нитритов можно рекомендовать два способа. 1. К 3—5-дневной культуре, выращенной на среде, содержащей нитраты, прибавляют несколько капель реактива Грисса (см. Грисса реактив). Розовое или красное окрашивание среды указывает на переход нитратов в нитриты. 2. К мясо-пептонному бульону, свободному от нитритов (проверяют реактивом, состав к-рого см. ниже), прибавляют 0,2% свободной от нитритов калийной селитры (KNO3), проверяют еще раз на содержание нитритов, разливают по 5 мл в пробирки (пятикратно промытые водопроводной водой), стерилизуют 15 мин. при t° 120°. Результат определяют на 3-й день после посева. Приготовление реактива:

1) 1 г крахмала растворяют в 100 мл кипящей дист, воды, остужают и добавляют 0,5 г йодистого калия;

2) 10% серная к-та (хим. чистая). Оба р-ра непосредственно перед реакцией смешивают в равных количествах. В течение 15 мин. (срок годности реактива) приливают 1 мл смеси в пробирку с засеянным бульоном. Темно-синее окрашивание среды, происходящее в результате взаимодействия йода с крахмалом, говорит о восстановлении нитрата в нитрит.

Среды с солями теллуристой кислоты. Некоторые микробы обладают способностью восстанавливать теллур из натриевой или калиевой соли теллуристой к-ты. Колонии этих бактерий на средах с солями теллуристой к-ты окрашены (цветн. рис. 20) в черный цвет. При применении с той же целью солей селенистой к-ты колонии окрашиваются в красный цвет.

Кровяной теллуристый агар. К 100 мл растопленного и охлажденного до t° 45—50° питательного агара (pH 7,6—7,8) добавляют 10 мл дефибринированной (или гемолизированной) лошадиной или бычьей крови и 2 мл 2% р-ра теллуристого калия (K₂TeO₄), тщательно размешивают и разливают в чашки Петри.

Селективные среды

Селективные среды содержат вещества, утилизируемые определенным микробом. Другие микроорганизмы этих веществ не используют для питания и не растут на подобных средах. Селективные среды позволяют направленно отбирать из загрязненного материала искомые бактерии, что особенно широко применяется при выделении патогенных энтеробактерий: для сальмонелл Плоскирева среда (см.). Обе эти среды выпускаются сухими.

Среда Козeра. В 1 л дист, воды растворяют 1,5 г фосфорнокислого натрий-аммония, 0,2 г сернокислого магния и 3 г лимоннокислого натрия. Разлитая но пробиркам и прошедшая стерилизацию при t° 120° в течение 30 мин. среда прозрачна. При росте цитратассимилирующих бактерий среда мутнеет.

Среда Симмонса. В 1 л среды Козера растворяют 20 г агар-агара, устанавливают pH 7,2. Прибавляют 10 мл 1,5% спиртового р-ра бромтимолового синего, фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при t° 120° в течение 15 мин. и скашивают. Цитратассимилирующие бактерии хорошо растут, подщелачивают среду и вызывают ее окрашивание в синий цвет (цветн. рис. 21 и 22).

Агар Энжеринга. К 2% мясо-пептонному агару прибавляют 0,2% олеиновокислого натрия. Палочка дифтерии на этой среде не растет, а другие коринебактерий (палочка Гофманна, дифтероиды) растут хорошо.

В мед. микробиологии Д.-д. с. широко применяют для идентификации микроорганизмов, содержащихся в исследуемом материале (выделения больного, объекты внешней среды и т. д.). Первичный посев на плотные питательные среды, содержащие лактозу и индикатор, широко применяют при поисках патогенных кишечных бактерий. Поскольку патогенные микробы семейства кишечных не расщепляют лактозу, в отличие от непатогенных, окраска среды и самих колоний помогает отличить их друг от друга. Подобную роль при поисках возбудителя дифтерии играют среды с солями теллура. На этих средах колонии дифтерийной палочки своей окраской резко отличаются от колоний других микробов. Это обстоятельство значительно облегчает работу по выделению чистых культур дифтерийных бактерий. Дальнейшую идентификацию коринебактерий дифтерии проводят с помощью жидких сред с другими углеводами (см. Дифтерия, этиология).

См. также Питательные среды.

Библиография: Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М., 1950; Мейнелл Д. Г. и Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология, пер. с англ., М., 1967, библиогр.; Многотомное руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, под ред. Н.Н. Жукова-Вережникова, т. 1, с. 308, М., 1962, библиогр.; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, М., 1973; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 41, М., 1973.

М. О. Биргер.