ИНТЕРФЕРОН

Интерферон (лат. приставка inter- между; гибель, уничтожение + ferre нести, переносить) — низкомолекулярный белок с противовирусными свойствами, содержащий некоторое количество углеводов, включая глюкозамин. Открыт в 1957 г. Айзексом и Линденманном (A. Isaacs, J. Lindenmanu), которые нашли, что клетки, инфицированные вирусом гриппа, начинают вырабатывать и выделять в окружающую среду особый белок, препятствующий размножению вирусов в клетках. В дальнейшем было установлено, что наряду с вирусами способностью вызывать образование Интерферона обладают многие микроорганизмы и некоторые вещества, полученные синтетическим путем (см. Индукторы интерферона).

Основное свойство Интерферона заключается в противовирусном действии, проявляющемся в подавлении размножения инфекционных и онкогенных вирусов. В зависимости от вида животных, в клетках к-рого продуцируется Интерферон, особенностей индуктора Интерферона наблюдаются вариации некоторых его констант. Мол. вес Интерферона колеблется от 12 000 до 160 000, а Изоэлектрическая точка — в пределах от pH 3 до 9.

В связи с вариабельностью физ.-хим. свойств Интерфероны стали определять как гетерогенный класс белков. Однако получены данные, что это является отражением состояния агрегации мономерных форм молекул вещества. В частности, в И. человека были найдены молекулы с мол. весом 96 000, 24 000 и 12 000. Более тяжелый И. в солевых р-рах низкой ионной силы может быть диссоциирован до более легкого. Мономеры по противовирусной активности не уступают димерам и олигомерам.

Характерным свойством И. является видовая специфичность его действия. Противовирусное действие И. более всего проявляется в организме или клеточных культурах того вида животных, в клетках к-рого он получен. Даже в клетках родственных видов он действует значительно слабее. Так, мышиный И. оказывает в клетках крысы и хомяка примерно в 20 раз более слабое противовирусное действие, чем в клетках мыши. В клетках человека, обезьян, курицы И. мышей лишен активности практически полностью. Исключением из этого правила является И. человека, активный и в клетках кролика.

И. обладает сравнительно низкой антигенной активностью. Гомологичный И. вообще не обладает антигенными свойствами. Препараты его стабильны в широком диапазоне pH. Даже при pH 12,5 И. полностью не разрушается и сохраняет до 10% активности. При pH 1,0 инактивируется 67% активности. Следует отметить, что резко кислые значения pH губительны для вирусов, в то время как И. проявляет устойчивость не менее 7 дней. Поэтому кислотоустойчивость И. используется для инактивации инфекционного вируса в препаратах И.

И. инактивируется протеолитическими ферментами — папаином (см.).

Термостабильность препаратов И. зависит от его происхождения. И. птиц устойчивее к действию нагревания, чем И. млекопитающих. Длительно сохраняет И. активность при 4—10°, а также в замороженном состоянии. Будучи высушен лиофильным методом, И. сохраняет активность в течение длительного времени. И. можно очищать и концентрировать, используя различные методы, применяемые в работе с белками. Весьма эффективна очистка И. методом хроматографии на твердофазном иммуноадсорбенте.

Способностью синтезировать Интерферон in vitro обладают как первичные, диплоидные, так и перевиваемые линии клеток фибробластического и эпителиального типов. Активными продуцентами И. являются также элементы белой крови человека и животных.

Количество образованного в клеточных культурах И. определяется видовыми и штаммовыми особенностями вирусов и клеток, активностью вирусов в данной культуре клеток и множественностью инфекции. Известно, что один и тот же вирус может индуцировать синтез И. в одной клеточной системе и не проявлять эту способность в другой.

Интерферон образуется также в организме людей и животных, инфицированных вирусами. Образование И. идет обычно параллельно с размножением вируса. Однако в некоторых случаях максимум продукции И. опережает или несколько отстает от максимума репродукции вируса в избирательно пораженных тканях. Вместе с тем при некоторых вирусных инфекциях (экспериментальный грипп) И. исчезает из организма раньше, чем вирус.

Интерферон, индуцированный у животных внутривенным введением вируса, рано (через 1 — 2 часа) появляется в крови и сравнительно быстро исчезает (через 24—36 час. он уже не обнаруживается в крови). И., рано выявляемый в крови после внутривенного введения индуктора, называют сывороточным И. Его образование не связано с размножением вируса. Период полувыведения И. из русла крови исчисляется несколькими минутами.

И., вероятно, является одним из наиболее биологически активных веществ. Напр., куриный И. при 20 000-кратной очистке имел специфическую активность 1,6 X 10³ ед. на 1 мг белка, а мышиный И.— 3 X 10⁸ ед. Но даже эти материалы не были достаточно очищенными.

И. не обладает избирательной противовирусной активностью и действует практически на все вирусы. Лишь на инфекцию, вызванную вирусом скрепи, не удалось воздействовать ни И., ни его индукторами. Интенсивность действия И. на различные вирусы неодинакова: одни вирусы более, а другие менее податливы к действию И. Установлено различие в чувствительности не только между разными видами вирусов, но и между штаммами одного и того ж о вида. Следует учитывать, что результаты определения активности И. зависят не только от чувствительности вируса, но и от чувствительности тканей к И. Известно, что некоторые клеточные культуры, являясь хорошими продуцентами И., не чувствительны к его действию.

Некоторые вирусы индуцируют в клетках особые ингибиторы (стимулон, блокер, антагонист И. и др.), которые подавляют образование или действие И. Следует подчеркнуть, что описанные свойства присущи только отдельным штаммам вирусов, которые вызывают образование ингибиторов Интерферона лишь в определенных типах клеточных культур.

Механизм действия

Интерферон непосредственно не инактивирует вирусы или их нуклеиновые к-ты, не препятствует адсорбции и проникновению вируса в клетку, а также его депротеинизации. Интерферон проявляет свое действие на внутриклеточном этапе репродукции вируса.

Механизм взаимодействия И. с клетками, в которых он индуцирует антивирусное состояние, остается неясным. По данным одних авторов, И. может индуцировать антивирусное состояние в клетках без обнаруживаемой потери активности, по другим — защитное действие И. связано с интенсивностью его поглощения. Для проявления действия И. должна сохраняться целостность клеточных рецепторов и способность клеток к синтезу РНК и белков, что, по мнению ряда исследователей, свидетельствует в пользу его опосредованного действия путем индукции в клетках особого противовирусного белка (АВБ).

Окончательно не решен вопрос о молекулярном механизме противовирусного действия И. Допускается действие И. на уровне транскрипции (см.). В пользу первого свидетельствуют данные о том, что И., не влияя на синтез вирусспецифических РНК, ингибирует синтез вирусных белков. И. не только уменьшает количество образующихся вирусспецифических полипептидов в зараженных клетках, но приводит также к укорочению полипептидных цепей. Предполагают, что И. или АВБ могут модифицировать вирусную РНК настолько, что она утрачивает способность участвовать в образовании полисом.

Сторонники действия И. на уровне транскрипции опираются на данные об ингибиторном действии И. на транскрипцию ранней вирусной РНК. Эта ингибиция связана с подавлением вирусиндуцированного синтеза, обусловленного вирионной РНК-зависимой полимеразой.

Некоторые авторы допускают существование двух способов действия И.— на транскрипцию и трансляцию — с преобладанием одного из механизмов при различных вирусных инфекциях. Наиболее распространенным является предположение о том, что в результате воздействия И. нарушается трансляция, что и обусловливает невозможность осуществления последующих этапов в репродукции вируса (см. Вирусы).

Методы индикации и титрования

Наиболее чувствительным методом титрования И. считается определение его действия на интенсивность размножения вируса в клетках, выявляемое либо по уменьшению вирусных гемагглютининов, либо по снижению «урожая» инфекционного вируса.

Для определения активности Интерферона чаще применяют методы, основанные на подавлении И. цитопатического действия вируса в пробирках или подавлении им бляшек (метод негативных колоний вируса по Дульбекко). Причем, последний в 16— 32 раза чувствительнее метода титрования по подавлению цитопатического действия в пробирочных культурах.

Следует иметь в виду, что максимальная резистентность обработанных И. клеток развивается не менее 7—8 час. после внесения препарата. Если И. из клеточных культур удаляется промыванием после достижения максимума резистентности, клетки нек-рое время сохраняют невосприимчивость к вирусу. Однако продолжительная инкубация клеток после удаления И. приводит к постепенной потере устойчивости.

На чувствительность системы к И. оказывают влияние многие факторы: вид индикаторного вируса и его доза, тип клеточной культуры, возраст клеток, длительность инкубации клеток с И. и pH среды. Для стандартизации методов титрования И. рекомендуется вводить в каждый опыт хорошо изученный стандарт активности И. и определять активность исследуемого материала в международных единицах.

Интерферон и восприимчивость к вирусной инфекции

Поскольку подавление размножения вирусов является важнейшей функцией И., его количество, образующееся в организме при вирусной инфекции, имеет важное значение в проявлении противовирусной резистентности. Чем больше вырабатывается И. в организме, тем более защищенным оказывается данный индивидуум. Вместе с тем потенциальные возможности выработки И. у отдельных людей и животных неодинаковы. Способность к образованию И. передается по наследству по законам Менделя (см. Менделя законы). Несмотря на генетическую детерминированность этого признака, его фенотипическое проявление существенным образом меняется на различных этапах физиол. развития организма. Способность интерферонообразования относительно низка у грудных детей, постепенно возрастает у детей старше 1 года, достигая максимума у взрослых. После 60-летнего возраста выработка И. резко снижается.

Способность к выработке Интерферона меняется также при различных неблагоприятных воздействиях на организм: охлаждении, облучении, шумовом стрессе, алкогольной интоксикации и т. п. К понижению образования И. ведет также нарушение обмена веществ, обусловленное как гиперфункцией, так и гипофункцией эндокринных желез.

Вырабатывать И. может практически любая клетка организма. Выработка И. начинается тотчас после проникновения вируса в организм. Его продуцируют те клетки, которые первично поражаются вирусом, т. е. выработка И. начинается уже во входных воротах инфекции. При этом, если даже инфекция ограничивается входными воротами, все же определенное количество клеток погибает. Разрушаются именно те клетки, которые первыми вступили в контакт с вирусом. Образованный этими клетками И. не успевает обеспечить резистентность самих клеток-продуцентов, однако окружающие клетки за счет И. обретают резистентность к вирусу.

И. рассматривается как один из важнейших факторов защиты организма при первичной вирусной инфекции. Вместе с тем далеко не всегда удается обнаружить соответствие между образованием И. и исходом вирусной инфекции (см. Иммунитет противовирусный).

Непротивовирусное действие

Противоинфекционное действие Интерферона не ограничивается только вирусами, а распространяется также на другие внутриклеточные паразиты. В частности, Интерферон подавляет внутриклеточное размножение возбудителя трахомы, малярийного плазмодия, токсоплазм и риккетсий. У И. выявлена также антитоксическая активность. При наличии И. клеточные культуры более устойчивы как в отношении экзо-, так и эндотоксинов.

И. влияет на активность антителообразующих клеток: малые дозы И. стимулируют их активность, а высокие концентрации — тормозят.

Полагают, что И. играет роль в клеточном иммунитете. В частности, лимфоциты людей и животных, чувствительных к туберкулину, продуцируют И. в ответ на воздействие очищенного белка туберкулина. У нечувствительных к туберкулину особей И. не продуцируется. Эти данные подкрепляются также тем, что резистентность животных к вирусным инфекциям, связанная с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, также в определенной мере обусловлена И.

И. усиливает фагоцитоз и влияет на реакцию отторжения трансплантата, подавляет трансформацию клеток онкогенными вирусами, рост опухолевых клеток in vivo и in vitro, повышает цитотоксичность лимфоцитов. Предполагают также, что И. участвует в контроле дифференциации клеток в организме.

И. может изменять ответ клеток на вирусные или невирусные индукторы И., либо усиливая, либо снижая выработку И. Кроме того, под влиянием И. клетки становятся чувствительными к разрушению их двунитчатыми РНК.

Препараты Интерферона подавляют рост нормальных клеток, угнетая синтез клеточной ДНК и белков, вследствие блокады трансляции клеточной иРНК. Полной уверенности, что именно И. обусловливает антиклеточную активность препаратов И., не имеется. Даже самые высокоочищенные препараты И. при проверке электрофоретическим методом оказывались гетерогенными.

Исходя из выявленного многообразия функций, считают, что в основе различных биол, феноменов, обусловленных И., лежит его способность регулировать синтез макромолекул в клетке.

Практическое значение

Использование И. для профилактики и лечения вирусных инфекций возможно по двум основным направлениям: 1) применение готового препарата (экзогенный И.), получаемого в системе клеток человека, 2) стимуляция в организме своего собственного, так наз. эндогенного И.

И. оказывает выраженный профилактический и лечебный эффект при заболеваниях, вызываемых многими вирусами. Целесообразно его применение при вирусных инфекциях с преимущественно местным поражением (дерматиты, глазные заболевания и др.). Особенно важным признается возможность применения И. при респираторных вирусных инфекциях, этиология которых разнообразна, и следовательно, вакцинопрофилактика их чрезвычайно затруднена.

Наилучший эффект дает И. при профилактическом применении. При развитии заболевания необходимо по возможности раннее его применение. Одним из основных путей повышения эффективности И. является увеличение кратности его введения.

Из других аспектов практического применения И. следует упомянуть разработанную В. Д. Соловьевым и Т. А. Бектемировым (1967) методику определения продукции И. лейкоцитами in vitro, к-рая была названа интерфероновой реакцией лейкоцитов (ИРЛ). Установлено, что ИРЛ при ряде вирусных инфекций может быть использована как показатель иммунореактивности организма. Вместе с тем показано, что определение продукции И. лейкоцитами может быть использовано для оценки реактивности организма в норме и при патол, состояниях не вирусного происхождения.

Из дополнительных материалов

Различают лейкоцитарный, фибробластный и иммунный интерфероны. Все они представляют собой индуцибельные белки, обладающие способностью вызывать в клетках развитие резистентности к последующему вирусному инфицированию. И. обладают универсальной противовирусной активностью, однако интерферонобусловленная защита клеток против отдельных вирусов отличается разной степенью выраженности. Эффективность И. наиболее интенсивно проявляется в гомологичных клетках, т. е. в клетках того вида животных, из к-рых были получены препараты И. (видовая специфичность действия). И. можно рассматривать как фактор неспецифической резистентности организма (см.) и как фактор, обладающий регуляторным воздействием на иммунную систему организма (см. Индукторы интерферона). отнесены к интерферонам I типа или соответственно к лейкоцитарному и ибробластному И. Интерферон, продуцируемый лейкоцитами в ответ на воздействие митогенов, напр. лектинов (см.), при пролиферации лимфоцитов или продуцируемый сенсибилизированными лимфоцитами в ответ на специфические бактериальные или вирусные антигены, назван интерфероном II типа или иммунным И. Отличительными свойствами интерферонов I и II типа, помимо условий их получения, являются также антигенные различия и их устойчивость в среде с pH 2,0 (интерферон I типа устойчив в этой среде, а интерферон II типа неустойчив). Деление II. на два типа (I и II) заменяется подразделением на типы, отражающие как источник получения И., так и их основные свойства. В соответствии с таким подходом различают альфа-интерферон (лейкоцитарный интерферон I типа), бета-интерферон (фибробластный интерферон I типа) и гамма-интерферон (иммунный интерферон II типа).

Международным комитетом по номенклатуре интерферонов предложено обозначать И. букваvи латинского алфавита IFN, а типы И.— буквами греческого алфавита α, β, γ. Для обозначения животных, от к-рых получены клетки — продуценты И., рекомендуется использование соответствующих приставок. Так, напр., для обозначения человеческого И. следует использовать приставку Ни (англ. human, лат. humanus человеческий) — HuIFN, для обозначения мышиного интерферона приставку Ми (англ. mouse, лат. mus мышь) — MuIFN и др. При описании отдельных И. с различным мол. весjм (массой) после названия И. в скобках следует приводить эту величину в килодальтонах. В тех случаях, когда И., продуцируемый клетками, представляет собой смесь известных типов И., рекомендовано в названии использовать указание на преобладающий компонент. Так, Интерферон, продуцируемый лимфобластными клетками и состоящий из смеси лейкоцитарного (87%) и фибробластного (13%) интерферонов, рекомендовано обозначать HuIFN-a(Ly). При этом не исключается возможность указания в скобках источника такого интерферона, напр, лейкоцитарный интерферон человека в таком случае хможно обозначать HuIFN-a(Le), а лимфобластный — HuIFN-a(Ly). Интерфероны, получаемые с помощью методов генной инженерии (см.), получили название генно-инженерных или клональных Интерферонов, бактериальных Интерферонов, геноферонов.

Полипептиды альфа- и бета-интерферонов состоят из 165—166 аминокислотных остатков, к-рым предшествуют 21—23 аминокислоты сигнального полипептида, отщепляемого в процессе посттрансляционного превращения молекулы интерферона и секреции ее из клетки. Структуры альфа- и бета-интерферонов обладают определенным сходством (до 30% гомологии на аминокислотном уровне), тогда как последовательности аминокислот в полипептидах альфа и гамма-интерферонов характеризуются лишь крайне незначительным совпадением. В среднем на одну молекулу И. приходится меньше одного углеводного остатка (глюкоза мин или галактоза мин). Это противоречит ранее существовавшему мнению, что И. представляет собой гликопротеин. Молекулы человеческого лейкоцитарного И. в большинстве своем лишены углеводов.

Различия в аминокислотном составе и последовательности аминокислот в полипептидах отражают различия в структуре генов, детерминирующих их синтез. В частности, семейство генов человеческого а-интерферона содержит по меньшей мере 20 различных генов. Нек-рые из этих генов являются неаллельными, другие же представляют собой аллельные варианты. Значительно меньше генов (до пяти) кодируют синтез (3-интерферона. Количество структурных генов для у-интерферона неизвестно.

Структурные гены И. человека локализуются в 9-й хромосоме, но не исключена возможность того, что часть их (или генов-активаторов синтеза И.) принадлежит 2-й, 5-й и 13-й хромосомам. В процессе индукции И. происходит активация соответствующих генов, что приводит к последующему синтезу (транскрипции) матричной РНК (мРНК), трансляция к-рой и обусловливает образование полипептидов И. Механизм образования И. подразделяется на две фазы — индукцию и продукцию интерферона. I фаза — индукция (процесс чувствителен к ингибиторам синтеза РНК) — состоит из следующих этапов: адсорбции индуктора И. на поверхности клеток; взаимодействия индуктора И. с соответствующими клеточными рецепторами; инициации индукции И.; дерепрессии генов И.; транскрипции (см.) матричной РНК для интерферона. II фаза — продукция (процесс чувствителен к ингибиторам синтеза белка) — включает следующие этапы: трансляцию РНК с образованием полипептида И.; посттрансляционные превращения полипептида И. с образованием так наз. интерфероида (предшественника И.); возможное гликозилирование (присоединение аминосахаров) интерфероида, образование молекулы И.; выделение (секрецию) И. из клетки.

Интерферон в клетках синтезируется после индукции de novo. Гипотезы о наличии в клетках предшественника и активации его в процессе индукции оказались ошибочными. Практически все ядросодержащие клетки позвоночных способны образовывать И., однако известны клетки, не способные к продукции И., напр, перевиваемые клетки линии VER О.

Процесс образования различных И. имеет разную продолжительность. Так, синтез альфа- или бета-интерферона завершается в пределах 8—12 час., у гамма-интерферона этот процесс более длителен. Напр., сенсибилизированные лимфоциты человека продуцируют у-интерферон в ответ на воздействие вируса осповакцины через 7—8 дней.

Генно-инженерный метод получения И. схематически сводится к тому, что из клеток животных, продуцирующих И., выделяют и очищают мРНК для И. и на матрице мРНК с помощью плазмид (см.), в к-рых кДНК соединена с активным прокариотическим промотором (см. Оперой). Полученные химерные плазмиды внедряют в бактерии (Escherichia coli, Bacillus subtilis) или дрожжи, к-рые и начинают продуцировать И., искусственный ген к-рого был внедрен в микробную клетку. Таким путем можно получать клоны бактерий или дрожжей, продуцирующих И. определенного типа в достаточно больших количествах, причем материальные затраты на получение такого И. во много раз меньше, нежели затраты на производство такого же количества И. в суспензиях лейкоцитов или в клеточных культурах. Однако такой генно-инженерный метод получения И. и получаемый И. не лишены ряда недостатков. Так, напр., отдельные клоны микробов продуцируют, как правило, лишь те полипептиды И., искусственный ген к-рых был введен в клетки-продуценты, а природный И. состоит из популяции полипептидов, кодируемых разными генами. Кроме того, необходима очистка И., полученного генно-инженерным методом, от антигенов бактериального (или дрожжевого) происхождения и др. Выход И., продуцируемого бактериями, достаточно высок — 8*10⁷ — 2*10⁸ ЕД в 1 л, что свидетельствует о перспективности этого метода.

И. обусловливает не только развитие резистентности клеток к вирусным инфекциям, но и воздействует на различные реакции иммунитета. И. следует рассматривать как регулятор (стимуляция или угнетение) различных механизмов иммунного ответа. К стимулирующим эффектам И. относят: повышение резистентности клеток к вирусному инфицированию, увеличение активности естественных лимфоцитов-киллеров (см. Опухоли), усиление фагоцитоза, экспрессию антигена главного комплекса гистосовместимости (см. Аллергия), угнетение пролиферации лимфоцитов, подавление роста клеток (в т. ч. и опухолевых), подавление реакции на трансплантат и реакции трансплантат против хозяина, подавление комплемента, подавление продукции И. клетками, обработанными гомологичным И. в больших дозах (блокинг-эффект).

Эффективность влияния И. на реакции иммунитета различна и зависит от природы И. Так, наибольшим антипролиферативным действием обладает иммунный интерферон (гамма-интерферон), к-рый оказался эффективнее бета- и альфа-интерферонов.

И. обладает также способностью защищать клетки от ионизирующего излучения, ему присуща антимитогенная активность, он может оказывать антитоксическое действие. Долгое время дискутировался вопрос об антибактериальной активности интерферона, т. к. нативные или частично очищенные препараты И. обладали антибактериальным действием. Однако последующие эксперименты, проводившиеся с хорошо очищенными препаратами И., показали, что они лишены антибактериальной активности.

Высокая биол. эффективность И., его способность влиять на реакции иммунитета не позволяет объяснить его действие на клетки и тем более на организм каким-то единым простым механизмом. Наиболее изученным является механизм противовирусного действия И. Необходимым условием успешного развития в клетках антивирусной резистентности, обусловленной И., является сохранение клеточного метаболизма (угнетение синтеза клеточных РНК и белка препятствовало и даже полностью предотвращало этот эффект И.).

Процесс взаимодействия И. с чувствительными клетками можно подразделить на ряд этапов: адсорбцию И. на клеточных рецепторах (вопрос о проникновении И. в клетку не решен окончательно, имеется достаточно много данных о том, что И. в клетки не проникает); индукцию развития антивирусного состояния; развитие антивирусной резистентности; возникновение выраженной резистентности к вирусному инфицированию.

Процесс развития антивирусной резистентности в клетках контролируется двумя генами. Один из них локализован в дистальном сегменте длинного плеча 21-й хромосомы и детерминирует синтез поверхностного рецептора для интерферона (локус IFRC), а другой, находящийся в 16-й хромосоме, регулирует антивирусное состояние.