ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + флюоресценция) — люминесценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего изучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом.

Метод микроскопии, основанный на явлении (процессе) И., носит название метода Кунса, метода И., метода люминесцирующих антител (сывороток) и применяется в практике как экспресс-метод при микробиол. диагностике инфекционных заболеваний. Его применяют также при изучении патогенеза инфекционных заболеваний, механизма антителогенеза, антигенного анализа биол, объектов.

Иммунофлюоресцентный метод является универсальным иммунохим. методом, сочетающим в себе достаточно точный морфол, анализ со специфичностью и высокой разрешающей способностью иммунол, методов. Он основан на использовании явления люминесценции для выявления реакции антиген — антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани.

Большое преимущество метода И. заключается в его простоте, высокой чувствительности, превосходящей некоторые другие серол, методы, а также в быстроте получения результатов. Можно, вероятно, локализовать и идентифицировать любое вещество, обладающее антигенными (гаптенными) свойствами, независимо от его природы и функции. Кроме того, метод И. вводит в круг исследований нерастворимые антигены тканей, которые недоступны изучению многими иммунол, методами, в частности иммунодиффузионными .

Метод И. был предложен в 1942 г. Кунсом (A. Coons) с соавторами и получил дальнейшее развитие в 50-х гг. после синтеза самого лучшего из существующих флюорохромов — изотиоцианата флюоресцеина (ФИТЦ). В эти же годы в СССР были начаты исследования по использованию этого метода и его совершенствованию.

Успех метода И. во многом зависит от качества люминесцирующих антител (сывороток), которые получают путем хим. реакции между специфическими антителами, содержащимися в иммунной сыворотке, и флюоресцирующим красителем — флюорохромом (см.). Полученный продукт реакции называют конъюгатом. В ряде случаев приготовление специфичных и активных конъюгатов — трудная задача. Обычно с флюоресцирующими красителями конъюгируют не цельные иммунные сыворотки, а фракции сывороточных белков, содержащих антитела. Причем чем лучше очистка от балластных белков, тем более качественный конъюгат можно получить впоследствии. Наилучшие результаты дает использование для метки препаратов чистых антител, но это, к сожалению, не всегда возможно. Качество конъюгата определяется также чистотой и активностью красителя, его количеством при метке, концентрацией белка и антител, величиной pH при метке, временем и температурой конъюгации, а также степенью очистки от балластных белков и избытка красителя и наличием гетеро логичных и нормальных антител.

Флюорохромы — это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10^-6—10^-9 сек.). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитол, препарате.

К флюорохромам, предназначенным для метки специфического белка, предъявляются следующие основные требования: цвет их флюоресценции должен отличаться от аутофлюоресценции объекта и контрастировать с фоном; они должны обладать высокой интенсивностью флюоресценции после присоединения к белку и не должны существенно изменять физ.-хим. и серол, свойства антител.

В практике используют флюорохромы, имеющие желто-зеленую, желтую и красную люминесценцию. Кроме ФИТЦ, применяют сульфохлорид родамина 200В (PCX), сульфофторид родамина 200В (РСФ), тетраметилродамин изотиоцианат (МРИТЦ), дихлортриазиниламинофлюоресцеин (ДХТАФ) и др.

Конъюгация белка с флюорохромом является хим. реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в к-ром краситель присоединен к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε-аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы.

Метод И. применяется в трех основных модификациях. При прямом методе [Кунс, Каплан (М. Kaplan), 1950] на препарат, содержащий искомый антиген, наносят специфическую люминесцирующую сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Преимуществом этого метода является его одноэтапность и использование небольшого количества контролей реакции.

При непрямом методе [Уэллер (Т. Weller), Кунс, 1954] препарат, содержащий искомый антиген, обрабатывают специфической немеченой сывороткой, несвязавшиеся белки отмывают и наносят люминесцирующую сыворотку к глобулинам немеченой сыворотки. В этом случае в качестве антигенов выступают связанные препаратом антитела первой сыворотки — немеченой. Преимуществом данной модификации является большая чувствительность, чем у прямого метода, и возможность использования ограниченного набора люминесцирующих антител.

Непрямой метод с комплементом [Гольдвассер, Шепард (В. Goldwasser, С. Shepard), 1958] является трехэтапным. Этот вариант заключается в использовании меченой антикомплементарной сыворотки, которая присоединяется к комплементу комплекса антиген — антитело. В такой постановке меченая сыворотка оказывается еще более универсальной.

К. А. Лебедевым с соавторами (1971) описана возможность проведения непрямого метода с использованием двух люминесцирующих сывороток (как антител против выявляемого антигена, так и антител против иммуноглобулинов того вида животных, от которых получена первая специфическая сыворотка).

Прямой метод выявления антител с помощью меченого антигена впервые применил Меллорс (В. Mellors) с соавт, в 1959 г. для доказательства присутствия ревматоидного фактора в определенных клетках организма. Этот вариант метода имеет ограниченное применение.

Во всех вариантах Иммунохим, сущность метода остается неизменной: локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген — антитело.

Методика приготовления препаратов различна и зависит от типа исследуемого препарата. Изучению подвергают мазки, мазки-отпечатки из органов, срезы органов, культуру ткани и пр. Для каждого антигена применяют свои фиксаторы. Препараты изучают под люминесцентным микроскопом (МЛ-2, МЛД-1, ЛЮМAM-2 и др.).

В связи с тем что в реакции И. участвует много компонентов, оценка надежности и точности результатов является обязательной частью исследования независимо от природы антигена, свойств и характеристики антител. Поэтому проводят контроль иммунол, специфичности наблюдаемого на препарате свечения и последовательно убеждаются в специфичности меченой сыворотки, качестве ее очистки, доказывают иммунол. характер обнаруживаемого свечения, проводят контроль фонового свечения с нормальной сывороткой, убеждаются в отсутствии реакции за счет антител к посторонним веществам и определяют иммунол, специфичность наблюдаемой реакции. Только после этого делают заключение о специфичности наблюдаемой реакции.

С целью повышения специфичности непрямого метода И. при выявлении тканевых антигенов применяют в качестве реактива меченые чистые антитела или конъюгаты с высоким титром антител, адсорбированные предварительно тканевыми порошками либо гомогенатами, не содержащими антигена, родственного специфическому антителу.

При выявлении бактерий, вирусов, риккетсий, простейших пользуются методами контрастирования неспецифического свечения. С этой целью используют бычий (или иной) альбумин, меченный родамином, синьку Эванса, конго красный и некоторые диазокрасители. При использовании метода контрастирования создают люминесцирующий фон, по цвету контрастирующий со специфическим свечением изучаемого объекта.