ИММУНОДИФФУЗИЯ

Иммунодиффузия (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + диффузия) — один из методов иммунологического анализа антигенов и антител, основанный на реакции преципитации.

Методы Иммунодиффузии получили широкое распространение в биологии и медицине при анализе антигенов тканей и особенно белков сыворотки крови, при исследовании антигенов опухолей и эмбриональных тканей. Основу метода составляет реакция между Антиген—антитело реакция) формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител. Метод, т. о., позволяет обнаружить отдельные антигены в сложных антигенных системах, напр, в биол, жидкостях или экстрактах из тканей, и специфические антитела в антисыворотках, не прибегая к специальному их фракционированию.

Формирующийся в геле специфический преципитат не задерживает неродственные компоненты. Место расположения полосы преципитации в геле определяется скоростью диффузии антигенов и антител и их концентрацией в исходных р-рах, т. к. образование преципитата возможно лишь при оптимальном количественном соотношении реагентов. В результате независимого действия этих факторов при анализе методом Иммунодиффузии сложных антигенных смесей с помощью полученных к ним поливалентных антисывороток (см. Сыворотки) в геле возникают дискретные полосы преципитации, соответствующие отдельным парам антиген— антитело. Это позволяет определять набор антигенов в исследуемых р-рах.

Реакцию проводят обычно в 1 — 1,5% геле из агара или агарозы на физиологическом р-ре или буферных р-рах со значениями pH, при которых не происходит Изоэлектрическая преципитация белков, т. е. в нейтральных или слабощелочных условиях.

Имеются несколько вариантов метода И. и многочисленные макро- и микромодификации. Метод И. впервые предложен Уденом (J. Oudin, 1946), разработавшим метод диффузии антигенов в гель, содержащий антитела, или метод простой диффузии. Реакция по У дену проводится в пробирках, в которых на столбик геля, предварительно смешанного с антисывороткой, наносят антигенный р-р. Антигены, диффундируя с различной скоростью в гель, реагируют с антителами и образуют полосы преципитации, постепенно смещающиеся в геле, т. к. при поступлении в гель новых порций антигена происходит смещение зоны оптимального соотношения антигенов и антител и растворение преципитата в избытке антигена.

Метод двойной диффузии по Оукли и Фулторцу (С. L. Oakley, A. J. Fulthorpe, 1953) в пробирках или в капиллярах: гель, содержащий антитела, и р-р антигенов разделены столбиком чистого геля. В результате встречной диффузии антигенов и антител зоны их оптимального соотношения в промежуточном геле не смещаются, и формирующиеся полосы преципитации в процессе реакции не мигрируют. Методы И. в столбиках геля применяют в основном для анализа набора антигенов в сложных антигенных системах и определения констант диффузии антигенов. Вместе с тем они мало пригодны для сравнения антигенов в разных системах.

Значительно более широкое применение в иммунохимии получил метод двойной диффузии в геле по Оухтерлоню (0. Ouchterlony, 1948, 1953). В этом варианте иммунодиффузии принцип выявления различных антигенов в сложных системах сочетается с возможностью прямой их идентификации в нескольких системах. Реакцию проводят в пластинках агарового геля на стекле или в чашках Петри. В застывшем геле на нек-ром расстоянии друг от друга вырезают лунки и заполняют их р-рами антигенов и антисыворотками. При оптимально подобранном соотношении антигенов и антител полосы преципитации формируются в геле между лунками. Т. к. реагенты диффундируют из лунок концентрически, метод позволяет провести одновременно несколько реакций, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с различными препаратами антигенов. Заполняя периферические лунки антисыворотками, а центральную — антигенным р-ром, можно исследовать набор антител в сыворотках разного происхождения. Характер соединения полос преципитации, образованных антигенами сравниваемых систем в реакции с одной и той же антисывороткой, неоднозначен и определяется степенью сходства или различия антигенов. Плавное полное слияние или частичное слияние полос преципитации на границе смежных реакций свидетельствует о полной идентичности или частичном сходстве антигенов, тогда как перекрещивание концов полос преципитации (т. е. образование «шпоры») — о неидентичности исследуемых антигенов.

Постановка реакции методом двойной диффузии по Оухтерлоню технически не сложна. Готовят 1 —1,5% гель из агара, в расплавленном состоянии агар разливают в чашки Петри или на стеклянные пластинки слоем в 1,5—3 мм. В застывшем геле вырезают лунки, число, форма, размеры и расположение которых зависят от конкретных целей опыта. Применяется линейное расположение лунок несколькими рядами, расположение по углам равностороннего треугольника, по «квадратной» схеме, предложенной Г. И. Абелевым (1960) для анализа двух полных систем антиген — антитело, по окружности с лункой для антисыворотки в центре или расположенной эксцентрично и другие варианты. Пластинки после заполнения лунок реагентами помещают во влажную камеру. Реакция развивается при комнатной температуре в течение нескольких часов или дней. Для регистрации результатов пластинки фотографируют; полосы преципитации на отмытых и высушенных пластинках окрашивают красителями на белок, в некоторых случаях возможно проведение гистохимических реакций для определения ферментативной активности антигенов.

Работа с поливалентными антисыворотками составляет один из первых этапов иммунодиффузионного анализа. Часто возникает необходимость исследовать не весь спектр антигенов, выявляемых поливалентной антисывороткой, а определенные антигены, интересующие исследователя. Для блокировки «ненужных» реакций гель предварительно насыщают соответствующими антигенами гетерологической системы.

Количественная оценка содержания антигенов в препаратах с помощью методов И. может быть получена при наличии моноспецифических антисывороток. Анализ проводят путем титрования антигенных препаратов и определения конечных их разведений, дающих положительную реакцию, в сравнении со стандартным образцом или тест-системой. Количественным методом определения содержания антигенов является также постановка реакций по методу радиальной иммунодиффузии Манчини (G. Mancini, 1965). При этом используют принцип диффузии антигенов в гель, содержащий антитела к исследуемому антигену. Определяя радиусы кольцевых зон преципитации, по предварительно построенной кривой зависимости их от концентрации данного антигена вычисляют содержание антигена в препарате.

Применение в иммунодиффузионном анализе радиоактивно меченных антигенов и антител привело к разработке методов иммуноавторадиографии, открывающих принципиально новые возможности в изучении антигенов.

Один из методов иммуноавторадиографии предназначен для исследования биосинтеза антигенов [Перельманн и Халтин (P. Perelmann, Т. Hultin), 1958; Г. И. Абелев, Р. Д. Бакиров, 1968]. Метод состоит из следующих этапов: а) включение меченных изотопами предшественников антигенов (напр., 14C-аминокислот для белков) в ткани in vivo или in vitro; б) проведение реакций И. с экстрактами тканей и специфическими антисыворотками к исследуемым антигенам; в) авторадиография реакций И. Для получения автор адиографических отпечатков отмытые от непрореагировавших веществ и высушенные пластинки агарового геля покрывают фотоэмульсией или накладывают высокочувствительную фотопленку. Время экспозиции устанавливают опытным путем. Сопоставление результатов иммунодиффузионного анализа при обычной регистрации и авторадиографии (см.) позволяет судить о наличии и синтезе антигенов в исследуемых тканях. Метод широко применяют также для анализа секреции антигенов. С этой целью кусочки тканей или диссоциированные клетки инкубируют в небольшом объеме среды, содержащей радиоактивно меченные предшественники, и в иммуноавторадиографии исследуют сконцентрированную культуральную среду.

Чувствительность методов И. при визуальной регистрации полос преципитации равна 1 — 4 мкг/мл. Для увеличения чувствительности иммунодиффузии Роу (D. S. Rowe, 1969) разработал метод непрямой иммуноавторадиографии. Принцип метода аналогичен принципу «сэндвича», используемому в непрямой иммунофлюоресценции (см. Иммунофлюоресценция), и заключается в выявлении невидимого преципитата в агаровом геле с помощью радиоактивно меченных иммуноглобулинов к антителам, содержащимся в преципитате. Для этого отмытые агаровые пластинки с реакциями обрабатывают р-ром меченных ¹³¹I или ¹²⁵I иммуноглобулинов к антителам того вида животных, от к-рого была получена иммунная сыворотка к исследуемому антигену. Авторадиография обработанных таким способом реакций И. позволяет обнаружить индивидуальные антигены в концентрации 0,1 — 0,05 м кг/мл.

Метод непрямой иммуноавторадиографии разработан как для радиальной (Роу, 1969), так и для двойной диффузии по Оухтерлоню (Д. А. Эльгорт, Г. И. Абелев, 1971). Помимо высокой чувствительности, метод обладает тем несомненным достоинством, что с его помощью можно легко проконтролировать участие антител иммунной сыворотки в образовании преципитата и т. о. исключить различные артефакты, которые могут исказить результаты исследования.

Методы Иммунодиффузии позволяют получать хорошо воспроизводимые результаты и выявлять антигены в сложных системах. Однако использование методов И. ограничено, т. к. их можно применять для анализа только растворимых антигенов и антител, при взаимодействии которых образуются преципитаты.

Библиография: Иммунохимический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, М., 1968; Методы биологии развития, под ред. Б. Л. Аетаурова, с. 434, М., 1974, библиогр.; Ouchterlony О. Handbook of immunodiffusion and immunoelectrophoresis, Ann Arbor, 1968.

В. М. Барабанов.