ЕРНЕ МЕТОД

ЕРНЕ МЕТОД (N. К. Jerne) — метод локального гемолиза в агаре, позволяющий определять количество антителопродуцентов в общей популяции лимфоидных клеток. Более правильно этот метод называть методом Ерне и Нордина (A. A. Nordin), т. к. первое его описание сделано обоими этими авторами в 1963 г. В целом Е. м. довольно прост, высокочувствителен и легко воспроизводим. Он расширил возможности иммунол, анализа и способствовал расшифровке многих иммунол, феноменов. Е. м. находит применение во многих разделах как теоретической, так и практической иммунологии.

Для постановки E. м. лабораторных животных иммунизируют гетерологичными эритроцитами, чаще барана. В различные сроки после иммунизации выделяют лимфоидные органы и готовят из них взвесь клеток. Далее эту взвесь и эритроциты барана по 0,1 мл добавляют к 2 мл расплавленного 0,7% агара, приготовленного на солевом р-ре или питательной среде. Смесь перемешивают и выливают в чашки Петри, которые после застывания агара помещают на 60 мин. в термостат при t° 37°. После инкубации к чашкам добавляют 2—3 мл комплемента (разведение 1:5 — 1:10). Чашки вновь инкубируют 30 мин. при t° 37° и после этого осуществляют учет результата реакции. При просматривании чашек в проходящем свете на розовом фоне невооруженным глазом видны мелкие очажки — участки лизиса эритроцитов («прямые бляшки»). В зависимости от условий опыта их диаметр может колебаться. При микроскопии с объективом 8 в центре зоны гемолиза видна одна клетка.

Предварительное прогревание клеточной взвеси при t° 56° (30 мин.), культивирование чашек со средой при t° 17°, добавление к агару ингибиторов клеточного дыхания (азида натрия, цианистого калия, антимицина А и т. д.) резко подавляют образование зон гемолиза.

В большинстве случаев клетка, находящаяся в центре бляшки, является продуцентом антител-гемолизинов. Подсчитав число зон гемолиза и зная количество лимфоидных клеток, добавленных к агару, можно вычислить, сколько антителопродуцентов находится в исходной суспензии. В конечном итоге делают перерасчет их количества на 10^6 лимфоидных клеток или на весь орган.

Исход Е. м. зависит от условий культивирования клеток. В опыте следует использовать агарозу или агар, причем при применении агарозы получаются лучшие результаты. Пригодность коллоидного носителя определяется отсутствием антикомплементарной активности. Кроме того, лучшие результаты получаются при использовании питательных сред № 199 или Игла (по сравнению с солевыми р-рами). В первом случае зоны гемолиза имеют больший размер и со временем увеличиваются. Возможно, на средах без аминокислот клетки только освобождают в окружающую среду антитела, образованные in vivo, а синтез новых молекул не происходит. В то же время присутствие в агаре нормальной сыворотки не ведет к существенному улучшению результатов. Десятикратные колебания концентрации эритроцитов (от 0,5 до 5%) не оказывают влияния на выявление антителопродуцентов. Комплемент можно добавлять к агару не только после часовой инкубации, но и в более поздние сроки. По данным Уэртиса (H. H. Wortis с соавт., 1968), в течение пятичасовой инкубации выявляется примерно одинаковое число антителопродуцентов. Перед постановкой опыта выделенные суспензии клеток можно хранить по крайней мере в течение 120 мин. при t° 4° без понижения количества антителопродуцентов.

Не все зоны гемолиза обусловлены клетками, секретирующими антитела. В отдельных случаях их образуют элементы, пассивно сорбирующие на всей поверхности антитела. Последние, в отличие от истинных антителопродуцентов, нечувствительны к ингибиторам клеточного дыхания [Роузмен (J. М. Roseman) с соавт., 1969].

С помощью Е. м. в основном выявляются клетки, синтезирующие IgM-антитела. Это связано с тем, что в реакции иммунного лизиса они значительно эффективнее IgG-антител.

В 1965 г. Штерцль и Риха (J. Sterzl, J. Riha) и Уэртис и Дрессер (H. H. Wortis, D. М. Dresser) нашли, что добавление в соответствующие разведения антисыворотки против IgG животного, являющегося донором лимфоидных клеток, увеличивает число зон гемолиза по сравнению с контролем. Эти дополнительные зоны лизиса называют непрямыми бляшками. Значительная их часть обусловлена клетками, синтезирующими IgG-антитела. Оказалось, что под влиянием антисыворотки против IgG гемолитическая активность IgG-антител резко повышается, и комплементзависимый лизис эритроцитов так же, как в случае IgM-антител, может возникнуть от одной молекулы IgG.

С помощью Е. м. установлено, что клетки, продуцирующие антитела к эритроцитам барана, присутствуют до иммунизации практически у всех лабораторных животных. У интактных животных фоновые антитело-продуценты в основном находятся в селезенке. В лимф, узлах их меньше, а в тимусе они практически отсутствуют.

После иммунизации эритроцитами барана число бляшкообразующих клеток резко увеличивается. Антителопродуценты в количестве, превышающем фоновый уровень, появляются на 2-й день после иммунизации, достигают максимума на 4-й день, после чего их количество резко падает. Применение высокочувствительной модификации (см. ниже) позволяет выявить бляшкообразующие клетки уже через 24 часа после иммунизации и число их в 4 раза превышает количество фоновых.

IgG-антителопродуценты появляются на 4-й день, достигают максимальных величин на 6-й день, далее их число постепенно понижается. При повторной иммунизации наблюдается более короткий инкубационный период, пик IgM- и IgG-антителопродуцентов формируется одновременно, на 5-е сут. после иммунизации, причем вторые резко превалируют над первыми. На максимуме первичного и вторичного ответа количество IgM- и IgG-анти-телопродуцентов составляет 1100 и 500, 200 и 1500 соответственно. При иммунизации животных растворимыми антигенами, полученными из эритроцитов барана, при первичном ответе в основном формируется популяция IgG-антителопродуцентов. Иммунизация же кроликов О-антигеном S. enteritidis вызывает преимущественное появление клеток, синтезирующих IgM-антитела. Используя высокочувствительную модификацию Е. м. и перенося с помощью микроманипулятора антителообразующие клетки на среды с различными антисыворотками, Носсел (G. J. V. Nossal) с соавт. (1971) показал, что популяция IgM-анти-телопродуцентов является гетерогенной в функциональном отношении.

Помимо классического Е. м., для изучения иммунного ответа к гетерологическим эритроцитам, широко используются его многочисленные модификации. Довольно часто применяется метод Каннингема (А. J. Cunningham, 1965), заключающийся в культивировании в жидкой среде в виде монослоя смеси из лимфоидных клеток, эритроцитов и комплемента. Зоны гемолиза учитывают микроскопически. Чувствительность метода в 3 раза выше классического.

Почти одновременно с Ерне и Нордином (1963) Ингрехем и Бассерд (J. S. Ingraham, A. Bussard, 1964) разработали метод идентификации антителопродуцентов в монослое из КМ-целлюлозы, эритроцитов, лимфоидных клеток, комплемента и питательной среды. Носсел с сотр. (1971) значительно усовершенствовал эту методику, резко повысил ее чувствительность (в 10—40 раз) и применил микроманипулятор для извлечения из зоны гемолиза антителопродуцентов .

Кеннеди и Аксельрад (J. С. Kennedy, М. A. Axelrad, 1971) предложили использовать вместо агара поли-L-лизин, обладающий сильным положительным зарядом и в силу этого связывающий эритроциты, что значительно облегчает морфол. и авторадиографические исследования антителопродуцентов.

Е. м. можно использовать не только для идентификации клеток, продуцирующих антитела к гетерологичным эритроцитам, но и к ряду растворимых антигенов.

Ланди (М. Landy) с соавт. (1965), В. В. Соловьев с соавт. (1966), А. А. Корукова (1971) показали, что при культивировании в полужидком агаре эритроцитов барана, нагруженных бактериальным полисахаридом (О- или Vi-анти-геном), и лимфоцитов животных, иммунизированных этим полисахаридом, в присутствии комплемента формируются зоны гемолиза (пассивный локальный гемолиз в агаре). Нагружать эритроциты можно также белковыми антигенами (бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин и т. д.) и гаптенами (динитрофенил, пенициллин и т. д.) при обработке их карбодиимидом, глютаральдегидом, перийодатом [Каплан и Фримен (А. М. Kaplan, М. J. Freeman), 1968; Голуб (E. S. Golub) с соавт., 1968]. Для идентификации клеток, синтезирующих антитела к бактериям (холерный вибрион, кишечная палочка), в Е. м. вместо индикаторных эритроцитов можно использовать эти микроорганизмы [Швартц, Браун (S. А. Schwartz, W. Braun), 1965; Мак-Алак (R. McAlack), 1971].

Морфологически клетки, образующие зоны лизиса, характеризуются большой гетерогенностью. К ним относятся большие и средние лимфоциты, бласты, плазмобласты, незрелые и зрелые плазмоциты, базофильные и небазофильные ретикулоциты и другие типы клеток с преобладанием при первичном ответе базофильных лимфоцитов [Кийохиро (I. Kiyohiro) с соавт., 1969]. При сочетании Е. м., авторадиографии и электронной микроскопии было показано, что на ранних этапах иммуногенеза действительно преобладают лимфоциты и бласты, а на более поздних стадиях начинают появляться плазматические клетки [Гудат (F. G. Gudat) с соавт., 1971]. Антителообразующие лимфоциты отличаются от обычных наличием хорошо развитого аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума. Фоновые антителопродуценты представлены только малыми и средними лимфоцитами.

Значительный процент бляшкообразующих клеток синтезирует ДНК. Клафлин и Смитиз (A. J. Claflin, О. Smithies, 1967) непосредственно наблюдали деление клетки, образующей зону гемолиза. Вследствие подвижности дочерних клеток, которые продолжали секретировать антитела, зона лизиса принимает асимметричную форму. Если после деления дочерние клетки с помощью микро-манипулятора перенести в новую среду культивирования, то после одинакового латентного периода они формируют одинаковые по размерам и очертаниям бляшки [Носсел и Льюис (Н. Lewis), 1971], т. е. являются абсолютно равноценными по функциональной активности.

Раппопорт (I. Rappoport, 1973) предложил вариант Е. м., по к-рому лимфоидные клетки длительно культивировали на миллипоровом фильтре и периодически делали им отпечатки на агаре с эритроцитами барана и комплементом. Это позволяет следить за динамикой секреции антител отдельными клетками.

Е. м. применяется для изучения способности клеток синтезировать антитела различных специфичностей. При иммунизации мышей эритроцитами барана и верблюда из более 16 тыс. исследованных антителопродуцентов ни одна не образовывала двух типов антител. Кроликов иммунизировали человеческим сывороточным альбумином, к к-рому фиксировали два различных гаптена. Затем каждый из гаптенов в отдельности присоединяли к эритроцитам барана и использовали в Е. м. Исследование показало, что ни одна из почти 28 тыс. клеток-антителопродуцентов не синтезирует антител двух специфичностей [Гершон (H. Gershon) с соавт., 1968]. С помощью модифицированного Е. м. показано также, что образование антител к различным антигенным детерминантам бычьего сывороточного альбумина происходит в различных клетках [Бенджамин, Вейгль (D. С. Benjamin, W. О. Weigle), 1970]. Метод реплик позволил установить, что при иммунизации двумя различными гаптенами подавляющее большинство иммуноцитов специализируется на синтезе антител одной специфичности, однако изредка (не более 1,4%) встречаются клетки, синтезирующие антитела против двух гаптенов [Ханна, Мерчент (E. Е. Hanna, В. Merchant), 1971].

Важным является вопрос, может ли одна клетка продуцировать различные классы антител одной специфичности. Для этого применяется метод реплик, когда клетки иммунизированных животных помещают между двумя слоями агара. Один агаровый слой содержит эритроциты барана и комплемент, к другому слою, помимо этих ингредиентов, добавлена антисыворотка против IgG. Т. о., получаются две реплики с действием одних и тех же клеток. Оказалось, что подавляющее большинство иммуноцитов синтезирует антитела только одного класса или подкласса. Но, по данным различных авторов, от 1,5 до 3,5% клеток продуцирует одновременно IgM- и IgG-антитела. Такие «двойные» клетки чаще выявляются на 7—9-й день после иммунизации и, возможно, связаны с переключением синтеза IgM- на синтез IgG-антител (Носсел с соавт., 1971).

Изучение аллотипических маркеров иммуноглобулинов с помощью антиаллотипических сывороток показало, что у гетерозиготных индивидуумов в зрелом плазмоците синтезируется иммуноглобулин, несущий только один из двух аллельных маркеров [Пернис (В. G. Pernis) с соавт., 1963]. Если кроликов с генотипом в4/в5 проиммунизировать эритроцитами барана, то каждая отдельная бляшкообразующая клетка продуцирует антитела только одного аллотипа [Брахми (Z. Brahmi), Ингрехем, 1970]. Для клеток, образующих зоны гемолиза, как и для всех иммуноцитов, секретирующих иммуноглобулины, характерен феномен аллельного исключения.

См. также Иммунокомпетентные клетки.

Библиография: Бабичев В. А., Утешeв Б. С. и Пинегин Б. В. Кинетика формирования популяции антителообразующих клеток при иммунологическом ответе, Усп. совр, биол., т. 78, № 4, с. 122, 1974, библиогр.; Фонта л ин Л. Н. Иммунологическая реактивность лимфоидных органов и клеток, М., 1967; J erne N. К. a. N о г d i n A. A. Plaque, formation in agar by single antibody-producing cells, Science, v. 140, p. 405, 1963; Sell S., Park A. B. a. N о r-d i n A. A. Immunoglobulin classes of antibody-forming cells in mice, J. Immunol., v. 104, p. 483, 1970, bibliogr.

Б. В. Пинегин.