БРИНКМАНА МЕТОД

БРИНКМАНА МЕТОД (J. Brinkman; в модификации Ε. М. Крепса и Е. Ю. Ченыкаевой) — определение активности карбоангидразы (К Ф 4.2.1.1) крови. Предложен в 1933 г. Фермент катализирует обратимую реакцию гидратации углекислого газа: CO₂ + H₂O ←→ H₂CO₃

В основе определения лежит измерение промежутка времени, за который происходит изменение pH среды в результате связывания молекул углекислоты карбонатами щелочного раствора:

H₂CO₃ + Na₂CO₃ → 2NaHCO₃.

Изменение pH среды определяют по изменению окраски раствора (индикатором служит феноловый красный). Время изменения цвета пропорционально скорости реакции гидратации углекислого газа и, следовательно, активности карбоангидразы.

Техника определения

Для установления времени спонтанной гидратации CO₂ проводят контрольную пробу. Для этого в U-об-разный сосуд, содержащий 2 мл ртути, наливают в одно колено 1 мл раствора I, приготовленного смешиванием 10 мл 0,1 н. раствора HCl с 10 мл 0,1 н. раствора NaHCO₃ и добавлением дистиллированной воды до 200 мл, а в другое — 1 мл раствора II, который готовят смешиванием 200 мл 0,5 М раствора NaHCO₃, 9 мл свежеприготовленного 0,5 М раствора Na₂CO₃ и 15 мг индикатора фенолового красного. Сосуд плотно закрывают пробками и ставят в ледяную баню. Рядом ставят две пробирки, в каждой из которых исходная смесь 1 мл раствора I и 1 мл раствора II. Пробирки служат стандартом для сравнения цвета. Через 10 мин. сосуд вынимают из бани, содержимое перемешивают, снова помещают в баню и замечают переход окраски от малиновой до оранжевожелтой. Время контрольной реакции 110—125 сек.

Измерение активности карбоангидразы производят следующим образом. В одно колено сосуда наливают 1 мл раствора I и тотчас же закрывают пробкой, а в другое — 0,05 мл крови (разведенной в 200 раз), а затем 1 мл раствора II, закрывают пробкой; затем сосуд погружают в ледяную баню. Через 10 мин. вынимают, перемешивают, снова помещают в баню, отмечая по секундомеру отрезок времени, необходимый для окончания реакции.

Рекомендуется каждую пробу повторить 2—3 раза. Наиболее тщательно следует отмеривать необходимый объем крови, что обеспечивает наибольшую чистоту проведения анализа. Мерой активности карбоангидразы (A) служит отношение скорости реакции с кровью (R0) к скорости реакции в контрольной пробе (R): A = (R-R0)/R0.

В норме активность фермента колеблется в пределах 2—2,5 ед. Отношение величины активности фермента к величине показателя гематокрита дает индекс карбоангидразы (в норме ок. 0,4 на 1 млн. эритроцитов). Активность фермента понижается при анемиях различного происхождения, нарушениях кровообращения, некоторых поражениях легких и др. Увеличение активности фермента наблюдается при сердечной недостаточности, при различных формах желтухи и других заболеваниях.

См. также Карбоангидраза.

Библиография: Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, с. 181, М., 1969; К р e и с E. М. и Ч e н ы к а e в а Е. Ю. Новые данные по обмену С02 у ракообразных и насекомых, Изв. АН СССР, отд. биол, наук, № 5, с. 310, 1945, библиогр.; Brinkman R. Occurrence of carbonic anhydrase in lower marine animals, J. Physiol. (Lond.), v. 80, p. 171, 1933.

H. В. Проказова.