БЕССЕЯ МЕТОДЫ

БЕССЕЯ МЕТОДЫ (О. A. Bessey) — количественные методы определения содержания витамина A и каротиноидов в сыворотке крови, витамина C — в лейкоцитах, а также активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови.

Определение витамина A и каротиноидов в сыворотке крови

Определение витамина А и каротиноидов в сыворотке крови (в модификации А. А. Анисовой). Метод основан на щелочном гидролизе эфиров витамина, экстракции витамина А и каротина с последующим спектрофотометрическим измерением поглощения света раствором до и после разрушения витамина А ультрафиолетовыми лучами.

В норме содержание витамина А в сыворотке крови колеблется от 30 до 70 мкг%, а каротина — от 80 до 230 мкг%. Понижение содержания витамина А в крови описано при гипертиреозе, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Оно сочетается с нормальным или несколько повышенным уровнем каротина (обычно чем ниже уровень витамина А, тем выше уровень каротина в крови). Эта каротинемия, по некоторым сведениям, связана с вовлечением в патологический процесс печени и является признаком, указывающим на тяжесть заболевания. При тяжелых общих заболеваниях (рак, туберкулез, инфекции) нарушается способность печени депонировать витамин А, увеличивается проницаемость почек и усиливается уже имеющийся гиповитаминоз.

Содержание витамина в крови понижается также при паренхиматозных поражениях печени и не меняется при обтурационной желтухе. Повышение уровня витамина А в крови обычно имеет место при гипотиреозе, болезни Иценко — Кушинга и некоторых других состояниях.

Техника определения. В центрифужную пробирку берут 1 мл крови (из пальца) и центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин; 0,12 мл сыворотки крови переносят в пробирку, добавляют такое же количество 1 н. спиртового раствора едкого кали, перемешивают и ставят для гидролиза в водяную баню на 20 минут при t° 60 °. Пробирки охлаждают в течение 5—10 минут (на льду), добавляют в каждую по 0,12 мл кси-лол-лигроиновой или ксилол-октановой смеси (1 : 1) для экстрагирования витамина. Затем пробирки вновь охлаждают и центрифугируют 8—10 мин. Верхний слой (ксилол-лигроиновый или ксилол-октановый экстракт, содержащий витамин А и каротиноиды) переносят в кварцевую микрокю-вету; в контрольную микрокювету наливают чистую ксилол-лигроиновую или ксилол-октановую смесь. Определение каротиноидов проводят при длине волны 460 нм, определение витамина А — путем двукратного измерения оптической плотности раствора при длине волны 328 нм (до и после облучения проб ультрафиолетовыми лучами). Исследуемые пробы облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны 310—410 нм в течение 45—60 минут.

Расчет. Содержание каротиноидов вычисляют по формуле:

X = 480·E460,

где X — искомое содержание каротиноидов в микрограмм-процентах; 480 — коэффициент Бессея для каротина; E460 — оптическая плотность раствора каротина.

Содержание витамина А вычисляют по формуле:

X = 637·(E1—Е2),

где X — искомая величина (в мик-рограмм-процентах); 637 — коэффициент Бессея для витамина А; E1— оптическая плотность раствора витамина А до облучения, а Е2 — после облучения.

См. также Ретинол.

Определение витамина С в лейкоцитах

Определение витамина С в лейкоцитах (в модификации А. А. Анисовой). Метод основан на выделении лейкоцитов и экстракции из них витамина С с последующим спектрофотометрическим определением содержания последнего.

В норме в лейкоцитах содержится от 20 до 30 мг% аскорбиновой кислоты.

При оценке получаемых значений аскорбиновой кислоты следует учитывать, что снижение ее содержания в лейкоцитах при недостаточном поступлении с пищей наступает позднее, чем в моче и плазме крови. Высокий уровень витамина С в лейкоцитах сохраняется при содержании его в крови не ниже 0,2 мг%. Клиническое значение витамина С — см. Аскорбиновая кислота.

Техника определения. В коническую пробирку с 0,5 мл 3,8% раствора цитрата натрия вносят 0,2 мл крови (из пальца), перемешивают и ставят на 5—7 минут на холод. Затем центрифугируют в течение 1,5—2 часов при 150—200 об/мин. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают верхний жидкий (мутный) слой, содержащий взвесь элементов крови, переносят в другую пробирку и центрифугируют 10 минут при 2500—3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку, состоящему из лейкоцитов, прибавляют 0,04 мл 5% раствора трихлор-уксусной к-ты и замораживают. Через 5—7 минут пробирку вынимают, размораживают в струе холодной воды (для разрушения стромы лейкоцитов и более полной экстракции витамина С) и центрифугируют 10 мин. при 2500—3000 об/мин. Отбирают микропипеткой 0,03 мл раствора, содержащего витамин С, добавляют 0,01 мл комбинированного реактива (100 объемных частей 2,2% раствора динитрофенилгидразина в 10 н. растворе серной кислоты, 5 частей 5% водного раствора тиомочевины и 5 частей 0,6% раствора CuSo₄·5H₂O в 0,1 н. растворе серной кислоты). Пробирку (закрытую притертой пробкой) помещают на 4 часа в термостат при t° 38°, затем в пробирку вносят 0,05 мл охлажденного 65% раствора серной кислоты и через 20 минут фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 520 нм.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты производят по калибровочным кривым, составленным для чистой аскорбиновой кислоты.

Определение активности фосфатаз в сыворотке крови

Определение активности щелочной (К.Ф.3.1.3.1) и кислой (К. Ф. 3.1.3.2) фосфатаз в сыворотке крови [по Бессею — Лаури — Броку (О. A. Bessey, О. Н. Lowry, М. J. Brock, 1946)]. В основу метода положена способность фосфатаз гидролизовать эфирную связь в п-нитрофенилфосфате, с освобождением п-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Интенсивность последнего характеризует степень активности ферментов.

Определение активности фосфатаз успешно применяют для дифференциальной диагностики заболеваний печени, костной системы и предстательной железы. Значительное повышение активности щелочной фосфатазы в случаях заболевания печени отмечено при механических желтухах, при острых гепатитах, холангитах, циррозах и особенно при желтой атрофии печени. Умеренная гиперфосфатаземия является одним из ранних спутников метастазов злокачественных новообразований. Увеличение фосфатазной активности характерно для рахита, причем степень активности обычно соответствует тяжести заболевания. Значительное повышение активности щелочной фосфатазы обнаруживается при остеомаляции, при болезни Педжета, при гиперпаратиреоидизме и других заболеваниях костной системы.

Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови используется для диагностики заболеваний предстательной железы, и в частности рака, когда происходит резкое повышение ее активности. Кроме того, по изменению активности кислой фосфатазы можно судить об эффективности терапевтического применения эстрогенов.

Техника определения. В пробирки вносят по 1 мл соответствующих субстратно-буферных растворов (0,05 М глициновый буфер и 5,5·10^-3 М раствор п-нитрофенилфосфата, pH 10,5 — для щелочной фосфатазы и 0,05 М цитратный буфер, 5,5·10^-3 М раствор п-нитрофе-нилфосфата, pH 4,8 — для кислой фосфатазы). Затем содержимое пробирок прогревают в термостате 5—10 минут при t° 37°; в опытные пробирки добавляют сыворотку (в пробу на щелочную фосфатазу 0,1 мл, на кислую 0,2 мл), перемешивают и инкубируют 30 минут при t 37°. После инкубации в пробу на щелочную фосфатазу добавляют 10 мл 0,02 н. раствора едкого натра, а в пробу на кислую фосфатазу — 4 мл 0,1 н. раствора NaOH; перемешивают и фотоколориметрируют при длине волны 405 нм (390—420 нм) в кювете с толщиной слоя 1 см против соответствующего контроля. Контроль ставят для каждой сыворотки. Расчет. Активность фермента выражают либо количеством микромолей п-нитрофенола, освободившихся под влиянием 1 мл сыворотки крови за 1 минуту при t° 37°, либо в условных единицах (количество фермента, которое освобождает 0,05 микромолей п-нитрофенола в условиях опыта).

См. также Фосфатазы.

Библиография: Биохимия и физиология витаминов, Методы определения витаминов, пер. с англ., под ред. H. М. Сисакяна и др., сб. 4, М., 1951; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, с. 162 и др., М., 1969.

В. Я. Максимов.