БЕРЧА-БЕССЕЯ-ЛАУРИ МЕТОД

БЕРЧА-БЕССЕЯ-ЛАУРИ МЕТОД (Н. В. Burch, О. A. Bessey, О. Н. Lowry)— метод количественного определения рибофлавина (витамина B₂) в крови.

Метод основан на экстракции различных форм рибофлавина из эритроцитов и цельной крови, последующем кислотном гидролизе флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флюориметрическом определении общего содержания рибофлавина.

Значение определения витамина B₂ и его физиологическая роль в организме — см. Рибофлавин.

Определение рибофлавина в эритроцитах

2—2,5 мл оксалатной крови центрифугируют при 1500—2000 об/мин в течение 1 часа. Жидкий слой вместе с небольшим количеством осадка отсасывают, а оставшуюся в пробирке суспензию вновь центрифугируют в течение 1 часа при t° 4°. Жидкий слой сливают, 0,5 мл эритроцитов переносят пипеткой в другую пробирку; пипетку споласкивают 1% раствором NaCl (0,5 мл), который сливают в центрифужную пробирку, добавляют 9 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и оставляют в темноте на 30—60 минут. Затем содержимое вновь перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Центрифугат переносят в пробирку с притертой пробкой, помещают в термостат при t° 37° на 20 часов для гидролиза ФАД, затем нейтрализуют (8 мл гидроливата переносят в пробирку, содержащую 2 мл 4М раствора K₂HPO₄, перемешивают и оставляют на 1—2 часа). После нейтрализации раствор выливают в кювету флюориметра и измеряют интенсивность флюоресценции с первичным светофильтром, имеющим максимум поглощения около 420 нм, и вторичным — максимум поглощения около 560 нм, после чего раствор снова сливают в пробирку, добавляют 0,1 мл стандартного рабочего раствора рибофлавина (20 мкг рибофлавина в 1 мл) и измеряют интенсивность флюоресценции, добавляют 0,5 мл 10% раствора гидросульфита (для гашения флюоресценции) и производят третий замер.

Расчет производят по формуле:

где А — количество рибофлавина в 1 мл стандартного раствора (в мкг), Б — объем анализируемой пробы (в мл), R₁ — первый замер интенсивности флюоресценции; R₂ — второй замер и R₃ — третий замер.

В норме содержание рибофлавина в эритроцитах составляет ок. 20 мкг%.

Определение общего содержания рибофлавина в цельной крови

1 мл оксалатной крови непосредственно после взятия вносят в центрифужную пробирку, добавляют 9 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и оставляют в темноте на 60 мин. Затем центрифугируют при 3000 об/мин. Надосадочную (прозрачную) жидкость помещают в термостат при t°37—38° на 20 часов для гидролиза, после чего нейтрализуют (к 4 мл гидролизата добавляют 1 мл 4М раствора K2HPO4 и оставляют в темноте на 1—2 часа). Интенсивность флюоресценции замеряют описанным выше способом.

Содержание рибофлавина в цельной крови в норме составляет около 12 мкг%.

Определение различных фракций рибофлавина в крови

Первый этап анализа — экстракцию рибофлавина 10% раствором трихлоруксусной кислоты — проводят на холоду (t° 4°), чтобы избежать гидролиза ФАД. После центрифугирования берут 4 мл холодного экстракта, тотчас нейтрализуют 1 мл 4М раствора K₂HPO₄ и замеряют интенсивность флюоресценции (получают значение I).

Оставшийся объем центрифугата помещают в термостат на 20 час. при t°37—38° для гидролиза ФАД, охлаждают, нейтрализуют и определяют интенсивность флюоресценции (значение II). Вычисление содержания ФАД производят по формуле:

Деление на 0,85 связано с тем, что значение I составляется из интенсивности флюоресценции флавинмононуклеотида (ФМН), свободного рибофлавина и 15% ФАД.

Фракция II более лабильна и изменяется в зависимости от степени обеспеченности рибофлавином в большей степени, чем ФАД.

При изучении обеспеченности организма витамином B₂ следует учитывать, что более ценным является определение содержания его в эритроцитах; содержание рибофлавина в лейкоцитах гораздо стабильнее; он долго сохраняется на нормальном уровне даже при недостаточном поступлении с пищей. В сыворотке крови содержание витамина B₂ настолько мало, что на обычном флюориметре он не определяется.

Библиография: Биохимия и физиология витаминов, Методы определения витаминов, пер. с англ., под ред. Η. М. Сисакяна и др., сб. 4, с. 113, М., 1951, библиогр.; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, с. 481, М., 1969; В u г с h H. В. Fluorimetric assay of cocarboxylase and derivatives, в кн.: Methods in enzimol., ed. by S. P. Colo-wick a. N. O. Kaplan, v. 3, p. 946, N. Y., 1957.

В. Я. Максимов.