Фекальная панкреатическая эластаза 1 тест-набор д/имуноферментного анализа:

ІНСТРУКЦІЯ

для медичного застосування діагностичного тестового набору ELISA –

Фекальна панкреатична еластаза 1

(Раncreatic Elastase 1 Stool Test)

1. Вступ

1.1 Патобіохімія

Людська панкреатична еластаза 1 (Е1) лишається незмінною протягом проходження через кишечник. Тому її вміст у фекаліях відображає екзокринну функцію підшлункової залози. При розвитку запалення підшлункової залози Е1 потрапляє в кров, тому визначення панкреатичної еластази 1 у сироватці може підтвердити або спростувати діагноз гострого панкреатиту.

1.2 Переваги

На відміну від загальноприйнятних лабораторних параметрів діагностики захворювань підшлункової залози - активності хімотрипсину в фекаліях, панкреатична еластаза 1 має такі переваги:

• Е1 абсолютно специфічна для підшлункової залози.
• Оскільки, Е1 стабільна протягом проходження через кишечник, вміст фекальної еластази 1 відображає секреторні можливості підшлункової залози (діагноз або виключення зовнішньосекреторної панкреатичної недостатності).
• Визначення Е1 добре корелює із "золотим стандартом" - секретин-панкреозимін та секретин-церулеїн інвазивними тестами.
• Індивідуальні варіації Е1 незначні.
• Замісна терапія не впливає на визначення Е1. Моноклональні антитіла, що використовуються в тесті, не мають перехресної реакції з еластазами тварин, які містяться у ферментних препаратах.
• Як і інші панкреатичні ензими, Е1 вивільняється в кровообіг при запаленні. Завдяки більшому періоду напіввиведення, ніж у амілази та ліпази, її концентрація залишається високою довше, таким чином діагноз гострого панкреатиту може бути встановлений навіть через 3-4 дні після виникнення хвороби.

Два тестових набори ELISA (що базуються на моноклональних антитілах) призначені для визначення панкреатичної еластази 1. За допомогою сироваткового тесту визначають Е1 у сироватці крові з метою встановлення або спростування діагнозу гострого панкреатиту або хронічного панкреатиту, а також для діагностики панкреатитів, обумовлених ретроградною панкреатохолангіографією або жовчо-кам’яною хворобою. За допомогою визначення фекальної Е1 діагностують або виключають панкреатичну зовнішньосекреторну недостатність, яка може розвиватися при хронічному панкреатиті, муковісцидозі, пухлинах підшлункової залози або цукровому діабеті.

1.3 Чутливість та специфічність

Діагностична ефективність визначення панкреатичної еластази 1 у фекаліях була вивчена в різних клінічних дослідженнях. Відповідно, Stein et al. (1993, 1996 & 1997) та Loser et al. (1995 & 1996) порівняли визначення Е1 із інвазивними інтубаційними тестами - секретин-панкреозимін та секретин-церулеїн тестами. Обидва автори встановили чутливість та специфічність понад 90% при встановленні зовнішньосекреторної недостатності. На відміну від визначення хімотрипсину, навіть помірна панкреатична недостатність може бути встановлена шляхом визначення Е1 (Loser et al.).

У дослідженні, яке проводилось Dominguez-Munioz et al. (1995), визначення Е1 порівнювалось з панкреоауриловим тестом. Відповідно до результатів, специфічність Е1 була більш високою при приблизно рівній чутливості.

Крім того, дослідження Terbrack et al. (1996), Soldan et al.(1996), Gullo et al. (1997) та Littlewood et al. довели відмінну чутливість та специфічність для діагностики муковісцидозу з ураженням підшлункової залози.

1.4 Основний принцип методу

На платівці ELISA розміщують моноклональні антитіла, що відповідають за людську пакреатичну еластазу 1 (Е1). Додають проби та стандартні зразки. Вміст ензиму визначається на підставі інтенсивності перекисного окислення АБТС ( 2, 2( - азино - біс - (3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота) діамонієва сіль), колір якої змінюється на темно-зелений. Концентрація окисленої АБТС вимірюється шляхом фотометрії.

1.5 Межі вимірювання

Панкреатична еластаза 1 може бути визначена в інтервалі від 0,3 до 10 нг/мл. Це відповідає концентрації ензиму в фекаліях між 15 та 500 mгЕ1/г фекалій та дуоденальній концентрації між 6 та 200 mгЕ1/мл дуоденального соку. Концентрація, менша за найнижчий стандарт, оцінюється як < 15 mгЕ1/г фекалій або < 6 mгЕ1/мл дуоденального соку.

1.6 Точність

Внутрішньолабораторна варіабельніть була визначена шляхом 20 подвійних досліджень 7 аналізів калу (36-450 mгЕ1/г фекалій). Середній коефіцієнт варіабельності (КВ) становив 5,8% (3,3-7,5%).

Зовнішньолабораторна варіабельність була підрахована при дослідженні 7 аналізів, які досліджувались протягом 10 різних днів. Середній КВ був 7,7% (4,1-10,2%; Scheefers-Borchel et al., 1992).

1.7 Можливі впливи на результати вимірювань

Нині відомі чинники, які не здатні впливати на результати тесту, наприклад, ферментативна замісна терапія не впливає на результати визначення еластази 1. У дуже поодиноких пробах фекалій, внаслідок розведення, результат визначення концентрації Е1 може бути заниженим. Тому рекомендується занотовувати консистенцію фекалій. У випадках, коли одержується патологічний результат (<200 mгЕ1/г фекалій), необхідно провести повторне дослідження більш оформленого калу.

2. Реактиви

1. 12 пластинок ELISA, з 8 чарунками, кожна, з моноклональними антитілами до людської панкреатичної Еластази 1 (Е1),

96 чарунків.

2. Концентрований буферний розчин (5х) (чорна кришка) 100 мл,

фосфатний буфер, рН 7,2, з пральним порошком.

3. Екстрагуючий буфер (5х) для проб калу (квадратний

 флакон, зелена кришка) 100 мл,

фосфатний буфер, рН 7,2, з пральним порошком та азидом натрію.

4. Е1 стандарти від 1 до 5, придатні до споживання (синя кришка) 

 700 mл в кожному,

людська панкреатична еластаза 1 у водному розчині з азидом натрію.

5. Контроль, придатний для споживання (фіолетова кришка) 700 mл,

людська панкреатична еластаза 1 у водному розчині з азидом натрію.

6. Другий тип моноклональних антитіл до Е1, кон¢югованої з біотином 

 (антиЕ1-біо) (жовта кришка) 150 mл,

у водному розчині з азидом натрію.

7. ПОД-Стрептавідин, світлочутливий (зелена кришка) 15 мл,

у водному розчині.

8. Розчин субстрату, придатний для споживання, світлочутливий (червона

 кришка) 15 мл,

АБТС у водному розчині.

9. Стоп розчин, придатний для споживання (біла кришка) 15 мл,

лужний водний розчин.

10. Пластиковий пакет із вологосорбентом для невикористаних пластинок ELISA.

 3. Матеріал для проб та стабільність проб

Матеріал проб: невелика кількість фекалій або дуоденального соку

Стабільність проб: проби можуть зберігатися три доби при температурі

4-8 ⁰С або до року при температурі - 20⁰С.

Екстракт фекалій можна зберігати при температурі 

4-8 ⁰С протягом одного дня.

4. Зберігання та стабільність тест-набору

Усі компоненти тест-набору стабільні при температурі 4-8 ⁰С до кінця терміну придатності, який зазначено на упаковці. Невикористані пластівки ELISA повинні зберігатись у добре заклеєному пластиковому пакеті, що містить вологосорбент.

5. Застереження

Тільки для діагностики in vitro. Буфери для екстракції, стандарти, контроль та антиЕ1-біо містять від 0,05% до 0,1% NaN₃ у якості стабілізатора.

Не можна змішувати матеріали різних партій.

6. Процедура тесту

6.1 Підготовка

6.1.1 Підготовка тестового/миючого буфера

100 мл концентрованого буфера 5х (чорна кришка) + 400 мл бідистильованої води. Розбавлений тестовий/миючий буфер придатний протягом 6 місяців при температурі 4-8 ⁰С.

6.1.2 Підготовка буфера для екстракції

100 мл буфера для екстракції 5х (квадратний флакон, зелена кришка) + 400 мл бідистильованої води. Розбавлений буфер для екстракції придатний протягом 6 місяців при температурі 4-8 ⁰С.

6.1.3 Підготовка пластинки ELISA

Залиште пластинку при кімнатній температурі перед відкриттям. Невикористані пластинки ELISA повинні зберігатися у добре заклеєному пластиковому пакеті, що містить вологосорбент.

6.1.4 Підготовка проб фекалій

Проби можуть бути зважені (переважаючий спосіб); також можуть використовуватись дозуючі прилади.

6.1.4.1 Зважування проб фекалій

Використовуйте для зважування проб цифрові лабораторні ваги. Необхідно відщепити невеликий шматочок фекалій (приблизно 100 мг).

Додайте до пробного зразка буфера для екстракції, відповідно до маси зразка: 100 мг - 10 мл буфера; 75 мг - 7,5 мл екстракту. Кінцева концентрація повинна бути 10 мг фекалій /мл буфера для екстракції.

6.1.4.2 Дозуючий прилад

Може бути використаний дозуючий прилад компанії Берінгер Манхайм (Німеччина, кат.№745804), який дозує зразки по 100 мг. Відповідно повинно бути додано 10 мл буфера для екстракції.

6.1.5 Гомогенізація

Суспензія фекалій повинна бути ретельно перемішана при кімнатній температурі (з використанням міксера). Фекалії мають бути гомогенізовані для повної екстракції панкреатичної еластази 1. Після екстракції, тривалістю понад 5 хв, суспензія ще раз перемішується. Після осідання проводять розведення. Зважаючи на те, що панкреатична еластаза 1 досить стабільна, екстракцію можна залишати (до 24 год) при температурі 4-8⁰С, та розведення робити наступного дня.

6.1.6 Розведення екстрактів фекалій (1:500)

Підготовка до розведення 1:500:

попереднє розведення (1:20): 50mл витяжки фекалій + 1 мл тестового/миючого буфера.

Остаточне розведення (1:500): 40 mл (1:20) + 1мл тестового/миючого буфера.

6.1.7. Розведення дуоденального соку (1:20000)

Підготовка до розведення 1: 20000:

попереднє розведення (1:100): 20 mл зразка + 2 мл тестового/миючого буфера.

Остаточне розведення (1:20000): 10mл (1:100) + 2 мл тестового/миючого буфера.

6.2 Процедура аналізу

6.2.1 Інкубація зразків та стандартів

Tаблиця 1

1-2 - дві смужки пластинки ELISA.

1-4 - чотири смужки пластинки ELISA.

1-12 - повна пластинки ELISA – 12 тестових смужок.

STD – стандарти; PC – позитивний контроль; S1-S4 – зразки.

Порожні – ячейки А1 и А2 містять 50 mл тестового/миючого буфера кожна.

Стандарти (синя кришка) – придатні для застосування; накапати 50 mл кожного стандарту (нерозчиненого) у смужки 1 та 2 двічі відповідно:

Стандарт 1 = 0,3 нг/мл

Стандарт 2 = 1,0 нг/мл

Стандарт 3 = 2,0 нг/мл

Стандарт 4 = 4,0 нг/мл

Стандарт 5 = 10,0 нг/мл

Контроль, придатний для застосування (фіолетова кришка); накапати 50 mл до ячейок G1 та G2.

Контроль = 4,0 нг/мл ± 10%

Накапати 50 mл витяжки фекалій, розведеної 1:500 (або дуоденального соку 1:20000), дві проби у дві сусідні чарунки.

Інкубувати 30 хвилин при кімнатній температурі

Промивання: випорожнити чарунки та промити кожну тричі тестовим/миючим буфером (8-канальною піпеткою, 250mл/чарунка). Перевернути пластинку та постукати по чистій паперовій серветці до повного видалення крапель рідини.

6.2.2 Інкубація з другим типом антитіла (анти Е1-біо)

Додайте 50mл/чарунка другий тип моноклональних антитіл, кон¢югованих з біотином – анти Е1-біо (жовта кришка), (розведений 1:100 безпосередньо перед використанням).

Для 4 тест-смужок (1/3 пластинки): 20 mл анти Е1-біо + 2мл тестового/миючого буфера.

Для 6 тест-смужок (1/2 пластинки): 30 mл анти Е1-біо + Змл тестового/миючого буфера.

Для 12 тест-смужок (ціла пластинки): 60 mл анти Е1-біо + 6мл тестового/миючого буфера.

Інкубувати 15 хвилин при кімнатній температурі

Промивання: Випорожнити ячейки та тричі промити кожну 250 mл тестового/миючого буфера.

6.2.3 Інкубація з ПОД – Стрептавідином

Додайте 50 mл/чарунка ПОД – Стрептавідин (зелена кришка), (розведеного 1:400 безпосередньо перед використанням).

Для 4 тест-смужок (1/3 пластинки): 5 mл ПОД - Стрептавідину + 2мл тестового/миючого буфера.

Для 6 тест-смужок (1/2 пластинки): 10 mл ПОД - Стрептавідину + 4мл тестового/миючого буфера.

Для 12 тест-смужок (ціла пластинки): 15 mл ПОД - Стрептавідину + 6мл тестового/миючого буфера.

Інкубувати 15 хвилин при кімнатній температурі в темному місці

Промивання: Випорожнити чарунки та тричі промити кожну 250 mл тестового/миючого буфера.

6.2.4 Кольорова реакція

Додайте 100 mл придатного до застосування розчину субстрату (червона кришка до кожної чарунки).

Інкубувати 5 хвилин при кімнатній температурі в темному місці

6.2.5 Зупинка кольорової реакції

Зупиніть реакцію з субстратом шляхом додавання 100 mл стоп – розчину (придатний до застосування, біла кришка) до кожної чарунки. Добре розмішати вміст чарунок шляхом збовтування.

6.2.6 Вимірювання

Визначте оптичну щільність при довжині хвилі 405 нм за допомогою мікротитруючого пластинчастого зчитуючого пристрою в проміжку часу 5 – 30 хвилин після внесення стоп-розчину. Добре змішайте вміст перед вимірюванням. 492 нм може бути використана як еталонна довжина хвилі.

6.3 Облік результатів

6.3.1 Неавтоматична оцінка

Підрахуйте середню оптичну щільність для кожного з подвійних досліджень.

Побудуйте графік, на якому вісь абсцис – це Е1- концентрація (нг/мл) стандартів, вісь ординат – відповідна оптична щільність стандартів, яка визначена при дослідженні. У такий спосіб, Ви отримуєте стандартну криву.

Концентрація Е1 в зразках може бути підрахована зі стандартної кривої на підставі визначеної оптичної щільності.

6.3.1.1 Проби фекалій

Для визначення концентрації Е1 у фекаліях (mг/1г фекалій) необхідно значення концентрації, визначене за стандартною кривою, помножити на 50 (з урахуванням кінцевого розведення).

6.3.1.2 Дуоденальний сік

Для визначення концентрації Е1 у дуодентальному соці (у mг Е1/1мл соку) необхідно значення концентрації, визначене за стандартною кривою, помножити на 20 (з урахуванням кінцевого розведення).

6.3.2 Облік результатів за допомогою програмного забезпечення ELISA

Розташуйте порожні, стандартні та дослідні комірки у відповідності до порядку, наведеного в таблиці 1. Застосуйте метод лінійної регресії. Помножте визначену концентрацію на відповідний коефіцієнт розведення або додайте чинник розведення (фекальні проби – чинник 50; дуоденальний сік – 20).

6.3.3.Еталонні показники концентрації панкреатичної еластази 1

у фекаліях:

норма:  200-500 та більше mг Е1/г фекалій

середня та легка екзокринна

панкреатична недостатність 100-200 mг Е1/г фекалій

тяжка панкреатична недостатність < 100 mг Е1/г фекалій

Вищезазначені концентрації Е1 визначені для оформлених зразків фекалій. При встановленні концентрацїї < 200 mг Е1/г фекалій, при дослідженні рідких зразків фекалій необхідно повторне дослідження оформлених зразків (див. розділ 1.7).

В дуоденальному соку:

Кожна клініка повинна визначити свої граничні показники.

Виробник лікарського засобу: „Чебо^®•Біотех АГ”/ ScheBo^®•Biotech AG

Адреса

вул. Нетанья 3-5, Д-35394, Гіссен (Німеччина)/ Netanyastrasse 3-5, D- 35394, Giessen (Germany)