Биофарма-амплисенс-пцр-hcv-fep тест-система д/выявл PНК вируса гепатита C №2 в компл:

Загальна характеристика

Тест-система «Біофарма-АмпліСенс-ПЛР-HCV-FEP» призначена для виявлення РНК вірусу гепатиту С в плазмі периферичної крові методом зворотної транскрипції (ЗТ) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції. Тест-система дає змогу виявляти РНК ВГС з чутливістю 250 МО/мл. Принцип тестування: виділення тотальної РНК з плазми крові разом з внутрішнім контрольним зразком; проведення реакції зворотної транскрипції РНК; проведення реакції ампліфікації з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією продуктів ПЛР.

Тест-система розрахована на 48 тестів, включаючи контрольні зразки.

Склад

Тест-система складається з двох комплектів реагентів:

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з плазми крові.

«ЗТ-ПЛР-HCV-FEP»

Комплект реагентів для проведення реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації (з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції).

Форма випуску

«Рібо-сорб-12» для виділення РНК:

До комплекту додаються наступні контрольні зразки:

Комплект розрахований на виділення РНК із 48 проб, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8^oС.

«ЗТ-ПЛР-HCV-FEP»  для реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації:

До комплекту додаються:

Комплект розрахований на 64 реакції, включаючи контролі і калібратори.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8^оСDTT, ОТ-ПЦР-суміш-1-FEP, ОТ-ПЦР-суміш-2-FEP/FRT, TM-ревертазу і полімеразу зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^оС.

Матеріали й устаткування.

Для виділення РНК з клінічного матеріалу – ЗОНА 1:

• твердотільний термостат для пробірок типу «епендорф» на 25–100^оС;
• мікроцентрифуга для пробірок типу «епендорф» до 12 тис.g;
• вортекс-«мініген» або «мікроспін»;
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;
• окремий халат і одноразові гумові рукавички;
• одноразові поліпропіленові пробірки, що загвинчуються або щільно закриваються об'ємом 1,5 мл;
• одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром;
• холодильник на 2–8^оС;
• вакуумний відсмоктувач з колбою-пасткою;
• ємність з дезинфікуючим розчином.

Для проведення реакцій зворотної транскрипції й ампліфікації, а також детекції продуктів ампліфікації – ЗОНА 2:

• ампліфікатор (наприклад, «Терцік», «ДНК-Технологія»);
• флуоресцентний ПЛР-детектор (наприклад, «Джин», «ДНК-Технологія»);
• ПЛР-бокс або окремий стіл, освітлюваний УФ-лампою;
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;
• одноразові поліпропіленові мікропробірки об'ємом 0,2 мл;
• одноразові наконечники для мікропіпеток з аерозольним бар'єром;
• холодильник на 2–8^оС і на мінус 20^оС;
• окремий халат і одноразові рукавички;
• ємність для скидання наконечників;
• комплект засобів для обробки робочого місця.

Підготовка до аналізу.

Збирання і збереження зразків.

Матеріалом для дослідження є плазма крові.

Одержання плазми крові.

Забір крові виконується натще з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8 – 1,1 мм) в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (3% розчин ЕДТА у співвідношенні 1:20) або спеціальну вакуумну систему типу «Venoject» (з ЕДТА), «Vacuett^®». Гепарин як антикоагулянт використовувати не можна! Пробірка закривається кришкою і перевертається кілька разів (для перемішування з антикоагулянтом). Плазму крові одержують центрифугуванням цільної крові (800 – 1600 g протягом 20 хв). Потім відбирають плазму окремими наконечниками з аерозольним бар'єром у стерильні пробірки типу «Епендорф» на 1,5 мл. Для виділення РНК використовується 100 мкл зразка плазми.

Зберігати плазму крові можна не більше трьох діб при температурі від 2 до 8°С, протягом 1 року – при температурі мінус 70 °С.

Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу. При заморожуванні клінічного матеріалу його транспортування повинне проводитися в замороженому стані.

Необхідно суворе дотримання правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму й особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ.

Працюють тільки в одноразових рукавичках, використовують і змінюють при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. Одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) повинний скидатися в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 0,2%-ний розчин ДП-2Т, 5%-ний розчин хлораміну Б або в спеціальну ємність з 1Nрозчином соляної кислоти.

Аналіз проводиться в два етапи в двох окремих приміщеннях (зонах).

Усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути строго стаціонарними. Забороняється їх перенос з одного приміщення в інше. Переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів ПЛР в інші приміщення заборонено.

Поверхні столів, а також приміщення, у яких проводиться постановка ПЛР, повинні обов'язково до початку і після початку робіт опромінюватися ультрафіолетовим світлом.

Проведення аналізу.

ЕТАП 1. Виділення РНК з плазми крові

Проводиться в ЗОНІ-1 -кімнаті для обробки клінічного матеріалу.

Порядок роботи.

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання прогріти при 60^оС до повного розчинення кристалів. Для виділення РНК з 12 проб, включаючи контролі, у баночку з лізуючим розчином додати стерильним наконечником з бар'єром 130 мкл внутрішнього контрольного зразку (ВКЗ). Вмісти ретельно перемішати. Суміш лізуючого розчину з ВКЗ зберігається не більш 30 хв.

2. У пробірки на 1,5 мл розкапати по 450 мкл приготовленої суміші лізуючого розчину з ВКЗ

3. У кожну пробірку додати по 100 мкл досліджуваної плазми, закрити кришку і перемішати на вортексі. Осадити на центрифузі для скидання крапель рідини з кришки.

4. Для кожної панелі необхідно поставити негативний контрольний зразок (НКЗ) і позитивний контрольний зразок (ПКЗ-1 ВГС). Для негативного контролю в пробірку з лізуючим розчином додати 100 мкл негативного контрольного зразку (НКЗ). Для позитивного контролю в пробірку додати по 90 мкл НКЗ і по 10 мкл позитивного контрольного зразку (ПКЗ), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.

5. Ресуспендувати сорбент, інтенсивно перемішуючи на вортексі. Додати в кожну пробірку окремим наконечником по 25 мкл ресуспендованого сорбенту.

6. Перемішати вміст пробірок на вортексі і залишити на 10 хв при кімнатній температурі, ретельно перемішуючи кожні 2 хвилини.

7. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хвилини.

8. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

9. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

10.  Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Відібрати етанол з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

11. Повторити відмивання розчином для відмивання 3.

12. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 4. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Цілком відібрати ацетон з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

13. Висушити сорбент, помістивши пробірки з відкритими кришками в термостат на 56^оС на 10 хв.

14. Ресуспендувати сорбент у 50 мкл РНК-елюента. Прогріти в термостаті при температурі 56^оС 5 хв, перемішати на вортексі й осадити сорбент на центрифузі при 10.000 g протягом 2 хв.

Увага! Отриманий препарат РНК збереженню не підлягає, ЗТ-ПЛР повинна бути проведена протягом 20 – 30 хвилин після виділення РНК!

ЕТАП 2. Проведення реакції зворотної транскрипції (ЗТ) і ампліфікації

(Загальний об'єм реакції – 50 мкл, об'єм РНК-проби – 25 мкл)

Увага! При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові видаткові матеріали, що мають спеціальне маркірування «RNase-free», «DNase-free».

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,5 мл.

2. Приготувати реакційну суміш. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT послідовно додати 300 мкл ЗТ-ПЛР-суміши-1-FEP, 200 мкл ЗТ-ПЛР-суміши-2-FEP/FRT, 20 мкл полімерази і 10 мкл ТМ-ревертази, ретельно перемішати на вортексі й осадити краплі з кришки пробірки.

3. Внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші. Невикористані залишки реакційної суміші викинути.

4. Зверху розкапати по 1 краплі мінеральної олії для ПЛР (приблизно 25 мкл).

5. Узяти підготовлені для ЗТ-ПЛР пробірки. Під олію або безпосередньо на поверхню олії внести по 25 мкл РНК-проб, використовуючи наконечник з аерозольним бар'єром (При додаванні РНК-проб необхідно уникати попадання сорбенту в реакційну суміш для ЗТ-ПЛР).

6. Для кожної панелі необхідно поставити 4 контролі ПЛР:

Контроль ампліфікації ПКЗ – у пробірку внести 25 мкл ДНК-калібратора ПКЗ HCV КЗ,

Контроль ампліфікації ВКЗ – у пробірку внести 25 мкл ДНК-калібратора ВКЗ HCV ВЗ

Два негативних контроля – у пробірку внести 25 мкл РНК-елюента. Одна з пробірок з негативним контролем при аналізі результатів буде використана як фонова пробірка.

7. Помістити пробірки в ампліфікатор і запустити програму «50-95-60».

Програма «50-95-60» для ампліфікатора «Терцик»:

50^оС – 30 хв

95 ^оС – 15 хв

42 цикла: 95 ^оС – 20 сек/ 60 ^оС – 20 сек/72 ^оС – 20 сек

8. Після закінченні виконання програми ампліфікації розпочати детекцію результатів.

ЕТАП 3 А. Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Джин»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу після закінчення ампліфікації).

Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Джин» проводиться відповідно до опису в «Паспорті детектора ПЛР флуоресцентний Джин».

Для детекції і обліку результатів використовуються стандартні настроювання* тесту «HCV» програми «Gene», задані за замовчуванням (Граничні значення для «-» 1,75; для «+» 2,1; для «ВК» 2,5).

* Настроювання тесту можна переглянути, вибравши меню «Настроювання», «Список тестів» у головному меню програми і, якщо значення змінені, потрібно відновити початкові значення, зазначені вище.

1. Включити прилад і запустити програму «Gene» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. Задати протокол виміру. Ввести кількість вимірюваних зразків і кількість фонових пробірок (1), вибрати потрібну інфекцію (HCV) у списку тестів у графі «Тест», натиснути кнопку «OK» (кнопкою миші) і ввести послідовність детектуємих зразків (у колонку «Зразок»).

3. Як зразок, позначеного «ФОН» використовувати пробірку з негативним контролем.

4. Поставити пробірки в осередки модуля приладу «Джин» відповідно до заданої послідовності (спочатку перші 12 зразків) і запустити детекцію, натиснувши кнопку, позначену значком кольорової призми, у панелі активних кнопок (вгорі екрана). Після закінчення детекції першої групи замінити пробірки на наступну групу пробірок і продовжити вимірювання, натиснувши кнопку «OK». Після закінчення детекції вийняти пробірки і натиснути кнопку «OK».

Облік результатів.

1. Отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «Gene» (стовпчик «Результат» на екрані). Позитивні зразки позначаються знаком «+» на червоному тлі; негативні зразки – знаком «-» на зеленому тлі; зразки, для яких отриманий сигнал, якому не можна однозначно інтерпретувати, що вимагають повторного аналізу, позначені знаком «?» на жовтому тлі; і зразки, у яких не детектується (не перевищує тла) як специфічний сигнал, так і сигнал ВКЗ, що потребує повторного аналізу, позначені знаком «нд» на жовтому тлі.

Приклад таблиці обліку отриманих результатів представлений нижче:

2. Результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення ДНК.

Таблиця. Оцінка результатів аналізу контрольних крапок

3. Відсутність позитивного сигналу на каналі.

4.  Зразки, у яких відсутній специфічний сигнал, як по каналі «Специфіка» так і по каналі «ВК», позначаються в графі результатів знаком «нд» (не детектується) на жовтому тлі. Ці зразки вимагають повторного проведення ПЛР і детекції. У випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. (Для зразка «K-» результат «нд» є нормою).

5. Відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем ПЛР може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущені на етапі постановки ПЛР. У такому випадку необхідно провести ПЛР ще раз.

6. Якщо в негативному контролі (НК або К-) детектується позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. У цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. Потрібно повторити аналіз проб, а також вжити заходів по виявленню джерела контамінації.

Чутливість виміру РНК ВГС тест-системи «Біофарма-АмпліСенс-ПЛР- HCV-FEP (Gene)» складає 250 МО/мл.

ЕТАП 3B. Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Ala-1»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу по закінченню ампліфікації).

Якщо виробником тест-системи не були задані параметри використовуваного тесту, то перед виміром флуоресцентного сигналу необхідно установити параметри тесту (див. нижче). Якщо такий тест існує, то необхідно переконатися у відповідності параметрів.

Порядок установки параметрів тесту «HCV-FEP».

1. Запустити програму «Ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. У головному меню програми вибрати «Настроювання» → «Tест».

3. Натиснути кнопку Новий (у верхньому правому куті).

4. В меню, що відкриється, задати назву тесту «HCV-FEP», натиснути кнопку ОК.

5. У групі параметрів Канали відзначити галочкою всі задіяні в тесті канали (FAM, HEX).

6. У групі УКЗ відзначити канал, що використовується для внутрішнього контролю (HEX).

7. У полях п- і п+ установити порогове значення для відношення сигнал/фон по каналі для детекції специфічної ДНК:

FAM: «п-» = 1.80, «п+» = 2.10;

В полі ВКЗ/фон задати порогове значення відносини сигналу по каналі для детекції ВКЗ до фону:

«ВКЗ/фон» = 2.5.

8. У групі параметрів Рівень фону установити значення флуоресценції, припустимі для фонових пробірок:

FAM: = 100.00;

HEX: = 100.00

Rox = 0.00;

9. Ввести назви мішеней у блок параметрів Прив'язка каналів і співвіднести їх з каналами детекції. Для цього надрукувати назву мішені у вільне поле і натиснути клавішу Додати, при цьому нова мішень з'явиться в стовпці вже існуючих у пам'яті приладу мішеней Назва мішені в стовпці Прив'язка каналів виділити курсором і натиснути відповідну їй кнопку каналу для детекції.

HCV = FAM

10. У поле Довірчий інтервал установити значення 200%.

11. Натиснути кнопку Зберегти.

Проведення виміру флуоресцентного сигналу.

1. Включити прилад і запустити програму «Ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. Задати протокол виміру. Для цього в головному меню вибрати «Протокол» → «Створити новий» або «Відкрити», щоб відкрити створений раніше протокол.

3. У вікні протоколу необхідно вибрати тип використовуваного ротора (36х0,5 або 48х0,2), відзначити номер протоколу, вибрати в меню-вкладці назву тесту «HCV-FEP».

4. У колонку Зразок послідовно заповнити список детектируємих зразків у порядку постановки в ротор (проти часової стрілки).

5. Позначити зразки, що є фоновими для даної групи зразків, як «фон» (використовуючи сполучення клавіш «Ctrl» і «F»). Як зразки, позначених «ФОН» використовувати пробірки з контрольними зразками «ФОН».

6. Перевірити, щоб у колонку Тест напроти кожного зразка був зазначений відповідний тест («HCV-FEP»).

7. Закрити вікно редагування протоколу, натиснувши на кнопку Exit у верхньому лівому куті панелі. Протокол зберегти.

8. Установити пробірки в осередки ротора відповідно до заданої послідовності і запустити детекцію, вибравши в меню «Протокол» → «Детекція» або значок детекція по протоколу в панелі інструментів (вгорі екрана).

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТІВ.

1. Отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «Ala-1». Результати в таблиці представляються за допомогою наступних позначень: «виявлений» – позитивний результат;

«не виявлено» – негативний результат;

«сумнівно» – результат, який не можна однозначно інтерпретувати (сигнал по каналі, відведеному для детекції специфічної ДНК, перевищує порогове значення, припустиме для негативних зразків, але не перевищує порогове значення для позитивних зразків (сигнал у так названій «сірій зоні»);

«нд» – недостовірний результат (у зразку не детектується (не перевищує заданого порогового значення) ні специфічний сигнал, ні сигнал УКЗ).

2. Результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення ДНК (див. Таблицю).

Таблиця . Результати автоматичної інтерпретації аналізу контрольних точок «HCV-FEP».

3. Зразки, для яких отриманий результат «сумнівний», вимагають повторного проведення ПЛР і детекції.

4. Зразки, для яких отриманий результат «нд» (крім К-), вимагають повторного проведення ПЛР і детекції. У випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. Для зразка «K-» результат «нд» є нормою.

5. Відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем ПЛР може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущених на етапі постановки ПЛР. У такому випадку необхідно провести ПЛР ще раз.

6. Якщо в негативному контролі (НК або К-) детектуєтся позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. У цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. Потрібно повторити аналіз проб, а також ужити заходів по виявленню джерела контамінації.

7. Якщо вимірювана частина пробірок забруднена флуоресціюючими агентами, значення флуоресценції в пробірках ФОН будуть перевищувати 200 одиниць. У цьому випадку необхідно протерти нижню частину пробірок 30-70% етанолом, висушити і повторити вимір.

Знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, вміщуючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б.

Умови і термін зберігання. Комплекти «РІБО-сорб-12» , «ЗТ-ПЛР-HCV-FEP» (крім DTT, ЗТ-ПЛР-суміш-1-FEP, ЗТ-ПЛР-суміш-2-FRT, ревертази і полімерази) зберігаються при температурі від 2 до 8 ⁰С. DTT, ЗТ-ПЛР-суміш-1-FEP, ЗТ-ПЛР-суміш-2-FRT, ревертазу і полімеразу з комплекту №2 зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^оС.

Термін придатності - 6 місяців.

Пакування

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з клінічного матеріалу.

Реактив:

Лізуючий розчин – 4 флакони по 5,8 мл;

Розчин для відмивання 1 – 4 флакони по 8,0 мл;

Розчин для відмивання 3 – 4 флакони по 15 мл;

Розчин для відмивання 4 – 4 флакони по 8,0 мл;

Сорбент – 4 пробірки по 0,4 мл;

РНК-елюент (DEPC-H₂O) – 4 пробірки по 1,0 мл;

НКЗ (негативний контрольний зразок) – 1 пробірка по 0,5 мл;

ПКЗ-1 HCV (позитивний контрольний зразок 1) – 4 пробірки по 0,01 мл;

ВКЗ HCV-FRT (внутрішній контрольний зразок) – 4 пробірки по 0,13 мл;

Комплект розрахований на виділення РНК із 48 проб, включаючи контрольні зразки.

«ЗТ-ПЛР-HCV-FEP”»

Комплект реагентів для проведення зворотної транскрипції й ампліфікації.

Реактив:

До комплекту додаються:

Комплект розрахований на 64 реакції, включаючи контролі і калібратори.

Виробник

ЗАТ «Трудовий колектив Київського підприємства з виробництва бактерійних препаратів "Біофарма".

Адреса

Україна, 03038, м. Київ, вул. М. Амосова, 9.