Биофарма-амплисенс-пцр-днк-вич-96 м тест-система д/выявл ДНК ВИЧ-1 №3 в компл:

Загальна характеристика

Тест-система призначена для виявлення ДНК вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ 1) у цільній крові методом полімеразної ланцюгової реакції.

Принцип тестування: виділення тотальної ДНК із цільної крові, проведення ампліфікації методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ділянки противірусної ДНК вірусу імунодефіциту людини з наступною гібридизаційно-ферментною детекцією продуктів ПЛР.

Опис. Тест-система складається з 3 комплектів реагентів:

«Цитолізин-ВІЛ» або «Імуно-сорб»

Комплект реагентів для виділення ДНК із клітин крові.

«АмпліСенс-96-R»

Комплект реагентів для ампліфікації ділянки ДНК (метод ПЛР).

Комплект реагентів для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК.

Форма випуску

«Цитолізин-ВІЛ» для виділення ДНК з клітин крові:

Комплект реагентів «Цитолізин-ВІЛ» розрахований на 100 проб по 0,25 мл, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8 ºС.

«Імуно-сорб», для виділення ДНК з клітин крові:

Комплект реагентів «Імуно-сорб» розрахований на 100 проб по 1,0 мл, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2ºС до 8ºС.

«АмпліСенс-96-R» для ампліфікації ділянки ДНК (метод ПЛР):

Комплект реагентів «АмпліСенс-96-R» розрахований на 96 реакцій, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8 ºС.

Комплект реагентів «ГіФА-96» розрахований на 96 тестів, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8ºС. Планшети, які сенсибілізовані зондами, зберігати при мінус 18±2⁰С.

Матеріали й устаткування.

Для виділення ДНК з клінічного матеріалу за допомогою комплекту "Цитолізин-ВІЛ" – ЗОНА 1:

• стерильна ламінарна шафа (наприклад, БОВ-001-АМС, м.Міасс, Росія або аналог);
• термостат для пробірок типу «Епендорф» на 25 –100 ^оС (наприклад, «ТЕРМО-24» фірми «Біоком», Росія або аналог);
• мікроцентрифуга для пробірок типу «Епендорф» до 16 000 g (наприклад, фірми «Eppendorf», Німеччина, фірми «Hettich», Німеччина або аналог);
• центрифуга/вортекс (наприклад, «ТЭТА-2», фірми «Біоком», Росія або аналог);
• вакуумний відсмоктувач з колбою-пасткою для видалення надосадової рідини (наприклад, фірми «Хелікон», Росія або аналог);
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, фірми «Ленпіпет», Росія або аналог);
• одноразовий халат і одноразові гумові рукавички;
• одноразові поліпропіленові мікропробірки на 1,5 мл, що загвинчуються або щільно закриваються (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• штатив для мікропробірок (наприклад, фірми «Хелікон», Росія, «Інтерлабсервіс», Росія або аналог);
• одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром у штативах (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• холодильник на 2 – 8^оC.

Для етапу виділення ДНК з клінічного матеріалу за допомогою комплекту «Імуно-сорб» потрібні:

• стерильна ламінарна шафа (наприклад, фірми «Міас», Росія або аналог);
• термостат для пробірок типу «Епендорф» на 25 – 100 ^ос (наприклад, «ТЕРМО-24» фірми «Біоком», Росія або аналог);
• напівавтоматичний екстрактор KingFisher ml (фірми «Labsystems», Фінляндія або аналог);
• пробірки і наконечники для екстрактора KingFisher ml (фірми «Labsystems», Фінляндія або аналог);
• мікроцентрифуга для пробірок типу «Епендорф» до 16 000 g (наприклад, фірми «Eppendorf», Німеччина, фірми «Hettich», Німеччина або аналог);
• центрифуга/вортекс (наприклад, «ТЭТА-2», фірми «Біоком», Росія або аналог);
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, фірми «Ленпіпет», Росія або аналог);
• одноразовий халат і одноразові гумові рукавички;
• одноразові поліпропіленові мікропробірки на 1,5 мл, що загвинчуються або щільно закриваються (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• штатив для мікропробірок (наприклад, фірми «Хелікон», Росія, «Інтерлабсервіс», Росія або аналог);
• одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром у штативах (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• холодильник на 2 – 8^оС.

Для етапу ампліфікації ДНК (метод ПЛР) – ЗОНА 2:

• ампліфікатор (наприклад, «Терцик», фірми «Днк-технологія», Росія або аналог);
• ПЛР-бокс або окремий стіл, освітлюваний УФ-лампою, наприклад, «Циклотемп» (фірми СП «РТС», Росія або аналог);
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, фірми «Ленпіпет», Росія або аналог);
• штативи для мікропробірок на 0,5 мл (наприклад, фірми «Хелікон», Росія або аналог);
• одноразові наконечники для мікропіпеток у штативах (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• холодильник на 2 – 8^оС;
• одноразовий халат і одноразові рукавички.

Для етапу гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК – ЗОНА 3:

• холодильник на 2-8 ^оС;
• термостат для мікропланшетів на 37 ^оС (наприклад, фірми «Elmi», Латвія або аналог);
• автоматична восьмиканальна піпетка перемінного об'єму на 200 мкл (наприклад, фірми «Ленпіпет», Росія або аналог);
• окремий комплект автоматичних одноканальних піпеток перемінного об'єму (наприклад, фірми «Ленпіпет», Росія або аналог);
• плашечний спектрофотометр (наприклад, «Мультіскан» фірми «Labsystems», Фінляндія або аналог).
• одноразові наконечники для автоматичних піпеток (наприклад, фірми «Axygen», США або аналог);
• мірний циліндр на 100 мл.

Запобіжні заходи.

Необхідно суворо дотримуватись правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму і особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ системи охорони здоров'я.

Працювати тільки в одноразових рукавичках, використовувати і змінювати при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. Одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) необхідно скидати в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 5%-ний розчин хлораміну Б.

Аналіз проводиться в три етапи в трьох окремих приміщеннях (зонах).

Усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути суворо стаціонарними. Забороняється переносити їх з одного приміщення в інше. Переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів ПЛР в інші приміщення повинне проходити під суворим контролем. Зміна верхнього одягу, головних уборів, взуття і рукавичок є обов'язковою умовою при виході з приміщення для детекції продуктів ПЛР.

Збирання і збереження зразків.

Для проведення аналізу використовувати свіжу цільну кров, узяту в кількості 4 мл в одноразову пробірку з 0,2 мл 3%-ного ЕДТА. Після забору пробірку з кров'ю закрити кришкою, перемішати перекиданням 3 – 4 рази і зберігати при температурі 2 – 8°С не більше 3 днів.

Проведення аналізу.

ЕТАП 1. Виділення ДНК із клінічного матеріалу

Проводиться в ЗОНІ 1 – приміщенні для обробки клінічного матеріалу.

Виділення ДНК за допомогою комплекту «Цитолізин-ВІЛ».

Обсяг клінічного матеріалу для виділення ДНК – 0,25 мл.

Порядок роботи.

Лізис клінічного матеріалу:

1. Узяти пробірки на 1,5 мл з кришкою, яка щільно закривається, для обробки необхідної кількості проб і контролів, промаркувати. У пробірки, призначені для клінічних проб, внести окремими наконечниками по 1,0 мл гемолітика і по 0,25 мл досліджуваної цільної крові відповідно маркіруванню. Закрити пробірки й акуратно перемішати вміст пробірки на вортексі. Якщо тестується кров новонароджених дітей, до 1,0 мл гемолітика додати 0,1 мл крові.

2. Залишити пробірки при кімнатній температурі на 3 хв; потім ще раз акуратно перемішати вміст пробірок на вортексі; залишити на 3 хв.

3. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 8 тис. об/хв протягом 2 хв. Надосадову рідину відібрати за допомогою вакуумного відсмоктувача, не зачіпаючи осаду.

4. До осаду додати 0,5 мл гемолітика, перемішати на вортексі і залишити на 3 хв.

5. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 8 тис. об/хв протягом 2 хв. Надосадову рідину відібрати за допомогою вакуумного відсмоктувача, не зачіпаючи осаду.

6. Повторити відмивання лейкоцитів гемолітиком. Після останнього відмивання осад клітин повинний бути білим, допускається наявність тільки невеликого нальоту рожевого кольору над осадом (залишки зруйнованих еритроцитів).

Отриманий осад лейкоцитів повинен бути негайно лізирований за допомогою цитолізину або заморожений при температурі мінус 70 ⁰С.

7. У кожну пробірку до осаду лейкоцитів додати по 50 мкл цитолізину, перемішати на вортексі до повного суспендування клітин.

Готування позитивного контролю.

8. В окрему пробірку, призначену для позитивного контролю, додати 45 мкл цитолізину і 5 мкл позитивного контрольного зразку з комплекту «АмпліСенс-96-R».

Готування негативного контролю.

9. В окрему пробірку, призначену для негативного контролю, додати 45 мкл цитолізину і 5 мкл ДНК-буферу з комплекту «АмпліСенс-96-R».

10. Пробірки поставити в термостат для мікропробірок на 30 хв при температурі 60 ^оС. Через кожні 10 хв перемішувати на вортексі для кращого розчинення клітинного осаду. Потім пробірки переставити в термостат на 100 ^оС (або переустановити температуру). Витримати 30 хв. Перемішати на вортексі.

11. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10 тис. об/хв протягом 1 хв. Проби готові

до постановки ПЛР.

Виділення ДНК за допомогою комплекту «Імуно-сорб».

Об'єми клінічного матеріалу для виділення ДНК – 1,0 мл.

Порядок роботи.

Лізис клінічного матеріалу.

1. Узяти штатив для пробірок із приладу KingFisher ml (штатив розрахований на 15 стрипів із пробірок). Поставити необхідну кількість стрипів у штатив (кожен стрип розрахований на виділення ДНК з однієї проби).

Прилад програмується таким чином, щоб обробка клінічного зразка здійснювалася в напрямку ліворуч праворуч.

2. У перші 2 пробірки кожного стрипу (крайні ліві) додати по 0,3 мл фосфатного буфера, у другі 2 пробірки кожного стрипу додати по 0,8 мл відмиваючого розчину, в останню пробірку кожного стрипу (крайні праві) додати по 50 мкл цитолізину-А.

3. У перші 2 пробірки кожного стрипу (крайні ліві) додати по 0,5 мл цільної крові, перемішати вміст акуратно наконечником з бар'єром. У першу пробірку додати по 30 мкл магнітних часток (перед використанням частки треба перемішати акуратно на вортексі). Магнітні частки необхідно додавати відразу після перемішування, тому що вони швидко осаджуються на дно пробірки.

4. Поставити штатив із пробірками в прилад KingFisher ml, надягти на магнітні стрижні наконечники. Запустити наступну програму:

5. Після закінчення програми вміст пробірок з останнього ряду перенести в окремі мікропробірки на 1,5 мл з кришками, які щільно закриваються (перед переносом вміст пробірок треба перемішати піпетуванням).

6. У мікропробірки внести окремими наконечниками по 4 мкл цитолізину-Б. Закрити пробірки і акуратно перемішати вміст пробірки на вортексі.

Готування позитивного контролю.

7. В окрему мікропробірку, призначену для позитивного контролю, додати 45 мкл цитолізину-А, 4 мкл цитолізину-Б і 5 мкл позитивного контрольного зразку з комплекту «АмпліСенс-96-R».

Готування негативного контролю.

8. В окрему пробірку, призначену для негативного контролю, додати 45 мкл цитолізину-А, 4 мкл цитолізину-Б і 5 мкл ДНК-буферу з комплекту «АмпліСенс-96-R».

9. Пробірки поставити в термостат для мікропробірок на 30 хв при температурі 60^оС. Через кожні 10 хв перемішувати на вортексі для кращого розчинення клітинного осаду. Потім пробірки переставити в термостат на 100^оС (або переустановити температуру). Витримати 30 хв. Перемішати на вортексі.

10. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10 тис. об/хв протягом 1 хв. Проби готові до постановки ПЛР.

ЕТАП 2. Ампліфікація ДНК (метод ПЛР)

Проводиться в ЗОНІ 2 – приміщенні для розкапування реагентів і проведення ПЛР.

Ампліфікація ДНК за допомогою комплекту «АмпліСенс-96-R».

Об'єм Днк-проби – 20 мкл; загальний об'єм реакції – 50 мкл.

Порядок роботи.

1. У пробірки з «ПЛР-сумішшю-1 ВІЛ» на поверхню застиглого воску розкапати по 20 мкл «ПЦР-суміші-2», при цьому вона не повинна «провалюватися» під віск і змішуватися з «нижньою сумішшю». Якщо використовується ампліфікатор без кришки, що підігрівається, то зверху розкапати по 1 краплі олії для ПЦР (приблизно по 25 мкл).

2. Під олію, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 20 мкл ДНК, виділеної з клінічних або контрольних проб.

Додаткові контролі реакції.

3. Як позитивні контролі ПЛР використовувати ПКЗ ДНК ВІЛ-1, розведений у 20 разів ДНК-буфером (10 копій у 20 мкл) і ПКЗ клітинної ДНК.

4. Як негативний контроль ПЛР використовувати ДНК-буфер.

5. Запустити на ампліфікаторі зазначену нижче програму:

6. Коли температура в ампліфікаторі досягне 95°С, помістити пробірки в осередки ампліфікатора, закрити кришку приладу і чекати закінчення реакції.

7. Після закінчення реакції зібрати пробірки в спеціальний штатив і відправити в ЗОНУ 3 для аналізу продуктів ампліфікації.

ЕТАП 3. Гібридизаційно-ферментний аналіз ампліфікованої ДНК

Проводиться в ЗОНІ 3 – приміщенні для аналізу продуктів ампліфікації.

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітниками лабораторії, які не проводять маніпуляцій у зоні 1 і зоні 2.

Гібридизаційно-ферментний аналіз за допомогою комплекту «ГіФА-96».

Порядок роботи.

Підготовка реагентів для гібридизації на мікропланшетах.

1. Приготувати однократний відмиваючий буфер, для чого до 20 мл 5-кратного буфера, попередньо прогрітого до 60^°С, додати 80 мл деіонізованої води. Зберігати при температурі 2 - 8^°С не більше 2 днів.

2. Кон'югат розчинити в кон'югатному буфері безпосередньо перед використанням (з розрахунку 9 мкл кон'югату в 0,9 мл буфера).

Проведення гібридизаційно-ферментного аналізу на мікропланшетах.

3. У пробірки з ампліфікованими пробами розкапати по 50 мкл денатуруючого розчину, перемішати піпетуванням і залишити на 10 хв при кімнатній температурі.

4. Обережно від'єднати від мікропланшета необхідну кількість стрипів з імобілізованим зондом до ВІЛ, і таку ж кількість стрипів з імобілізованим зондом до клітинної ДНК.

5. Гібридизаційний буфер (ГБ) розкапати у лунки мікропланшету (стрипу) з імобілізованим зондом по 100 мкл. Прогріти 10 хв при 37^°С у термостаті для мікропланшетів.

6. Додати в лунки з прогрітим ГБ денатуровані проби ( 25 мкл у лунку з зондом до ВІЛ і 25 мкл у лунку з зондом до клітинної ДНК), перемішати піпетуванням. Накрити мікропланшет (стрипи) захисною плівкою і поставити на 37 ^°С у термостат для мікропланшетів на 1 годину.

7. Видалити ГБ із лунок і промити 5 разів відмиваючим розчином, щоразу ретельно видаляючи його залишки (об'єм, що заливається в одну лунку  при відмиванні, дорівнює 200 мкл).

8. Додати в лунки по 100 мкл розведеного кон'югату, накрити мікропланшет (стрип) захисною плівкою і поставити на 37 ^°С у термостат для планшетів на 20 хвилин.

9. Видалити кон'югат з лунок і промити 5 разів відмиваючим розчином, щоразу ретельно видаляючи його залишки.

10. Додати в лунки по 100 мкл субстрату ТМБ. Поставити в темне місце на 10 хвилин. У лунці, що відповідає позитивному контролю, повинно з'явитися блакитне фарбування. Реакцію зупинити, додавши в лунки по 100 мкл стоп-реагенту, при цьому блакитне фарбування повинне змінитися на жовте.

Облік результатів.

Облік результатів роблять спектрофотометрично при довжині хвилі 450 нм безпосередньо в мікропланшетах на фотометрах типу «Мультискан», «Уніскан» і т.п.

Оптична щільність негативного контрольного зразку не повинна перевищувати 0,30 ОО. Оптична щільність позитивного контрольного зразку повинна бути не менш 1,0 ОО. Оптична щільність всіх аналізованих зразків, крім НК і ПКЗ ВІЛ, у лунках, сенсибілізованих зондом, комплементарним клітинної ДНК, повинна бути не менш 0.5 ОО. Зразки, для яких був отриманий оптичний сигнал менше 0,5 ОО (у випадку аналізу клітинної ДНК), повинні бути перетестовані, починаючи з етапу виділення ДНК з клінічного матеріалу. Позитивними у відношенні ВІЛ вважаються зразки з оптичною щільністю понад 1,0 ОО (у лунках, сенсибілізованих зондом, комплементарним ВІЛ).

Позитивні зразки з оптичною щільністю від 0,3 ОО до 1,0 ОО (у лунках, сенсибілізованих зондом до ВІЛ) рекомендується тестувати повторно у двох крапках. Якщо у всіх трьох крапках оптична щільність попадає в діапазон від 0,3 до 1,0 ОО, пробу варто вважати позитивною.

Знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, поміщаючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б.

Умови і термін зберігання.  Комплекти зберігаються при температурі від 2⁰С до 8⁰С, крім Цитолізину-Б і планшетів. Цитолізин-Б і планшети зберігається при мінус 18±2 °С.

Термін придатності

6 місяців.

Пакування

"Цитолізин-ВІЛ".

Реактив:

Гемолітик – 2 флакони по 100 мл; 

Цитолізин – 1 флакон по 5,0 мл.

Комплект реагентів «Цитолізин-ВІЛ» розрахований на 100 проб по 0,25 мл, включаючи контрольні зразки.

"Імуно-сорб"

Реактив:

Фосфатний буфер   – 1 флакон по 60 мл;

Відмиваючий розчин  – 2 флакони по 80 мл;

Магнітні частки   – 6 пробірок по 0,45мл;

Цитолізин-А   – 1 флакон по 5,0 мл;

Цитолізин-Б   – 6 пробірок по 0,08 мл;

Комплект реагентів «Імуно-сорб» розрахований на 100 проб по 1,0 мол, включаючи контрольні зразки.

"АмпліСенс-96-R"

Реактив:

ПЛР-суміш-1 ВІЛ  – 96 пробірок по 0,01 мл;

ПЛР-суміш-2  – 2 пробірки по 1,0 мл;

Мінеральна олія для ПЦР – 1 пробірка по 4,0 мл;

ДНК-буфер  – 1 пробірка по 1,0 мл;

ПКЗ ДНК ВІЛ-1  – 1 пробірка по 0,2 мл;

ПКЗ клітинної ДНК   – 1 пробірка по 0,2 мл;

Комплект реагентів «АмпліСенс-96-R» розрахований на 96 реакцій, включаючи контрольні зразки.

Комплект реагентів для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК.

Реактив:

Денатуруючий розчин – 1 флакон по 5,0 мл;

Гібридизаційний буфер (ГБ) – 2 флакони по 10 мл;

Кон'югатний буфер (КБ) – 2 флакони по 10 мл;

Кон'югат  – 2 пробірки по 0,12 мл;

Відмиваючий буфер (ВБ), 5-кратний - 3 флакони по 100 мл;

Субстрат ТМБ  – 2 флакони по 10 мл;

Стоп-реагент – 2 флакони по 10 мл;

Планшет, сенсибілізований ДНК-зондом до ВІЛ – 1 шт;

Планшет, сенсибілізований ДНК-зондом до клітинної ДНК – 1 шт.

Виробник

ЗАТ «Трудовий колектив Київського підприємства з виробництва бактерійних препаратів "Біофарма".

Адреса

Україна, 03038, м. Київ, вул. М. Амосова, 9.