УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Ультрацентрифугирование — метод разделения гл. обр. высокомолекулярных соединений, их агрегатов, субклеточных структур и вирусов под действием центробежной силы. В основном Ультрацентрифугирование используют в научно-исследовательской работе. Однако аналитическое Ультрацентрифугирование может эффективно применяться для постановки и уточнения диагноза, напр. при количественном определении идентификации вирусов (см.) и др.

Ультрацентрифугирование производят в аналитических или препаративных ультрацентрифугах, скорость вращения ротора в к-рых достигает 80 000 оборотов в мин., а ускорение центробежной силы в сотни тысяч раз превышает ускорение силы земного тяготения. В таких условиях происходит полисахаридов (см.) и др.

Ротор ультрацентрифуги вращается в вакууме при давлении ок. 10^-3 мм. рт. ст., создаваемом форвакуумным и диффузионным насосами, и приводится в движение чаще всего электрическими моторами. В аналитических ультрацентрифугах в отверстия ротора вставляют так наз. ячейки, представляющие собой металлические цилиндры с центральной вставкой, имеющей секториальную полость и зажатой между двумя кварцевыми стеклами. Объем этой полости составляет 1 мл и меньше. Объем пробирок в препаративных ультрацентрифугах зависит от максимальной скорости вращения ротора.

Для наблюдения за процессом седиментации и регистрации границ седиментации в аналитических ультрацентрифугах имеется несколько оптических систем, из к-рых чаще всего используют абсорбционную и рефрактометрическую (так наз. шлирен-систему). Абсорбционная система регистрирует степень поглощения света р-ром в ячейке в зависимости от расстояния от оси вращения. Эту систему применяют при исследовании разбавленных р-ров (концентрация ок. 0,005%) нуклеиновых к-т (при длине волны 260 нм) и белков (при длине волны 230 нм). Шлирен-система позволяет регистрировать градиенты показателей преломления (или концентраций) в виде пиков, соответствующих границам седиментации или флотации. Шлирен-систему применяют для анализа р-ров белков и других высокомолекулярных соединений с концентрацией ок. 0,5%.

Основными методами аналитического У. являются определение скорости седиментации и седиментационного равновесия. В первом случае речь идет о движении границы седиментации от мениска к дну ячейки или границы флотации от дна ячейки к мениску. Этот метод применяют для определения гомогенности веществ, их коэффициентов седиментации или флотации, а также для определения других параметров (см. Седиментация). При определении седиментационного равновесия при У. достигается такое состояние, когда поток вещества за счет седиментации сравнивается с потоком за счет диффузии. Этот метод используют для определения мол. веса (массы).

Основными методами препаративного У. являются дифференциальное, зонально-скоростное и равновесное (изопикническое) У. Дифференциальное У. основано на раздельном осаждении частиц на дно пробирок. Для этого подбирают такую скорость и время вращения ротора ультрацентрифуги, чтобы в осадке были самые крупные частицы, а в надосадочной жидкости оставались менее крупные. При ультрацентрифугировании 1 г гомогената ткани (после его отстаивания в течение 20 мин.) при скорости вращения ротора ультрацентрифуги, соответствующей ускорению центробежной силы 1000 g через 5—20 мин. на дно центрифужной пробирки оседают ядра и оставшиеся неразрушенными (интактные) клетки, при 10 000 g (20 мин.) — митохондрии, лизосомы и др., при 100 000 g (1 — 2 часа) — свободные рибосомы и микросомы, при дальнейшем центрифугировании со скоростью вращения ротора, соответствующей ускорению примерно 400 000 g, осаждаются растворенные белки, нуклеиновые к-ты и другие макромолекулы. При зонально-скоростном У. р-р разделяехмых компонентов наслаивают на более плотную среду. Последнюю готовят, создавая в пробирке для У. градиент концентрации сахарозы (применяют также глицерин, фиколл и др.), напр, от 10% у мениска до 30% у дна. Такой градиент концентрации предотвращает конвекционное размывание зон седиментирующих компонентов. После достижения оптимального разделения зон У. прекращают, зоны извлекают (напр., прокалывая дно пробирки иглой от шприца, т. е. «раскапывая градиент»). Затем изучают компоненты выделенных зон по тем или иным свойствам. В этом случае разделение белков, нуклеиновых к-т и др. происходит в соответствии с их коэффициентами седиментации. При равновесном (изопикническом) У. пробирки заполняют р-ром разделяемых компонентов в присутствии больших количеств, напр., хлористого цезия CsCl2 (применяют также сернокислый цезий Cs₂SO₄, метризамид и др.). Во время У. возникает градиент плотности хлористого цезия, причем плотность р-ра у мениска должна быть меньше, а плотность раствора у дна — больше плотности исследуемых компонентов. В таком случае эти компоненты будут седиментировать или флотировать до тех пор, пока не достигнут слоя, в котором плотность хлористого цезия равна плавучей плотности исследуемых компонентов (так наз. изопикническая область). При этом движение компонентов прекратится и возникнет равновесное состояние. Отбор проб производится так же, как и при зонально-скоростном У. Разделение смеси частиц при равновесном У. осуществляется не по коэффициентам седиментации, а по плавучей плотности .

Для препаративного Ультрацентрифугирования применяют роторы разных типов. В угловых роторах пробирки вставляются в гнезда под углом к оси вращения, седиментация в этом случае происходит в направлении радиуса на стенки пробирок, а по ним — на дно пробирок. Эти роторы обычно применяют для дифференциального У. В роторах со свободно подвешенными гильзами с пробирками (так наз. бакет-роторы) гильзы во время вращения ротора принимают горизонтальное положение и седиментация происходит параллельно стенкам пробирок. Такие роторы обычно используют для зонального и равновесного У. с градиентами концентрации или плотности поддерживающей среды. Для этих же целей стали использовать так наз. зональные роторы. Эти роторы имеют большую внутреннюю полость, в к-рой создание градиента (напр., концентрации сахарозы) и отбор проб происходит при малых скоростях вращения ротора (ок. 2000—3000 оборотов в мин.), а разделение осуществляется при максимальных скоростях его вращения.

Библиогр.: Боуэн Т. Введение в ультрацентрифугирование, пер. с англ., М., 1973; Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, Электрофорез и ультрацентрифугирование, М., 1981.

В. О. Шпикитер.